酶切鉴定-BamHI and EcoRI.ppt
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1、质粒DNA的酶切鉴定,限制性内切酶是DNA操作过程中所使用的基本工具。其特异性地结合于一段特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上,并在此切割双链DNA。分子克隆中常用的为II类限制酶,其识别位点长度为4、5或6个核苷酸的反向重复序列。限制酶的切割点因酶而异,有些产生带平端的DNA片段,而另一些产生带有粘性末端的DNA。,实验原理,限制性内切酶切割DNA,Construction of pGEX-740,A:,B:,Strategy of construction,C: Identify positive clone,The product of PCR,在一个洁净的1.5 ml离心管中混匀下列
2、反应物:,实验方案,注意采用混合配样,酶切一小时后,每管加入5 ul的6xloading buffer,中止反应,混匀。 2025 ul上样,在一个泳道中加入10 ul DNA Marker。,根据核酸的解离性质,用中性或偏碱性的缓冲液使核 酸解离成阴离子,置于电场中便向阳极移动,这就是 电泳。 凝胶电泳有许多优点:简单、快速、灵敏、成本低。 常用的凝胶电泳有琼脂糖(agarose)凝胶电泳和聚丙烯 酰胺(poly-acrylamide)凝胶电泳。可以在水平或垂直 的电泳槽中进行。凝胶电泳兼有分子筛和电泳双重效 果,所以分离效率很高。,核酸电泳,(一) 琼脂糖凝胶电泳 以琼脂糖为支持物。电泳的
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