5.1《DNA的粗提取与鉴定》教案.doc
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1、挫折其实就是迈向成功所应缴的学费DNA的粗提取与鉴定【考试说明要求】1.制备和应用固定化酶(A)2. 酵母细胞的固定化(B)【课堂活动】基础回顾一、实验原理1DNA的溶解性 DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,利用这一特点,选择适当的盐浓度(如2mol/L)就能使DNA充分溶解,而使杂质沉淀,或者相反(DNA在浓度为0.14mol/L的NaCl溶液中,溶解度最小),以达到分离目的。此外,DNA不溶于酒精溶液,但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理,可以将DNA与蛋白质进一步的分离。2DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 蛋白酶能水解蛋白质,但是对DNA没有影响。大
2、多数蛋白质不能忍受6080oC的高温,而DNA在80oC以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜,但对DNA没有影响。3DNA的鉴定 在沸水浴条件下,DNA遇二苯胺会被染成蓝色,因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。二、实验材料的选取 凡是含有DNA的生物材料都可以考虑,但是使用DNA含量相对较高的生物组织,成功的可能性更大,如鸡血(原因:DNA含量丰富,材料易得,鸡血细胞吸水易胀破)。若用动物组织如猪肝,则需研磨。三、过程1破碎细胞,获取含DNA的滤液 动物细胞的破碎比较容易,以鸡血细胞为例,在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水,同时用玻璃棒搅拌,过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞,需要先用洗涤
3、剂溶解细胞膜。例如,提取洋葱的DNA时,在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐,进行充分的搅拌和研磨,过滤后收集研磨液。注意:为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂?蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体,水分可以大量进入血细胞内,使血细胞胀裂,再加上搅拌的机械作用,就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂),从而释放出DNA。加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么?洗涤剂是一些离子去污剂,能溶解细胞膜,有利于DNA的释放;食盐的主要成分是NaCl,有利于DNA的溶解。如果研磨不充分,会对实验结果产生怎样的影响?研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全,提取的DNA量变少,影响实验结果,导致看不到丝状沉淀物
4、、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分?可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。2 去除滤液中的杂质 方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同;方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质,不分解DNA;方案三的原理是蛋白质和DNA的变性温度不同。注意:为什么反复地溶解与析出DNA,能够去除杂质?用高盐浓度的溶液溶解DNA,能除去在高盐中不能溶解的杂质;用低盐浓度使DNA析出,能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此,通过反复溶解与析出DNA,就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。方案二与方案三的原理有什么不同?方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白,从而使提取的DNA与蛋白质分开
5、;方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同,从而使蛋白质变性,与DNA分离(6075的恒温水浴保温1015min)。3 DNA的析出与鉴定 将处理后的溶液过滤,加入与滤液体积相等、冷却的酒精溶液,静置23min,溶液中会出现白色丝状物,这就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌,卷起丝状物,并用滤纸吸取上面的水分。取两支20ml的试管,各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml,将丝状物放入其中一支试管中,用玻璃棒搅拌,使丝状物溶解。然后,向两支试管中各加入4ml的二苯胺试剂。混合均匀后,将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后,比较两支试管溶液颜色的变化,看看溶解有DNA
6、的溶液是否变蓝。四、注意事项1以血液为实验材料时,每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠防止血液凝固。2加入洗涤剂后,动作要轻缓、柔和,否则容易产生大量的泡沫,不利于后续步骤地操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时,动作要轻缓,以免DNA分子的断裂,导致DNA分子不能形成絮状沉淀。3二苯胺试剂要现配现用,否则会影响鉴定的效果。4DNA的溶解度与NaCl溶液浓度的关系:当NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时,随浓度的升高,DNA的溶解度降低;当NaCl溶液浓度高于0.14mol/L时,随浓度升高,DNA的溶解度升高。5盛放鸡血细胞液的容器,最好是塑料容器。鸡血细胞破碎以后释放出的DNA,容易被玻璃容
7、器吸附,由于细胞内DNA的含量本来就比较少,再被玻璃容器吸附去一部分,提取到的DNA就会更少。因此,实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管,这样可以减少提取过程的DNA的损失。诊断检测1.下列图示中能反映DNA溶解度与NaCl溶液浓度之间关系的是:2.在DNA粗提取的实验过程中,得到的丝状物主要成分就是DNA, 依据是 A丝状物易溶于2molL的氯化钠溶液中 B丝状物溶解后,遇二苯胺(沸水浴)变蓝色 C丝状物能在约为O14molL氯化钠溶液中析出 D加酒精可使溶解的丝状物再被析出3.在“DNA的粗提取与鉴定”实验中,向5mL血细胞液中加入20mL蒸馏水的目的是A.使血细胞破裂 B.防止血液凝固 C
8、.析出DNA D.使蛋白质与DNA分离4.在NaCl溶液中反复溶解、析出并过滤,就能除去DNA溶液中的杂质的理由不包括 ( ) A用高浓度盐溶液溶解DNA,能除去在高盐中不能溶解的杂质 B用低浓度盐溶液使DNA析出,能除去溶解在低盐溶液中的杂质 C反复操作就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质 D反复操作就能够使各种杂质变性而沉淀析出典例引路在采用鸡血为材料对DNA进行粗提取的实验中,如果需要进一步提取杂质较少的DNA,可以依据的原理是( )A.在物质的量浓度为0.14 mol/L的氯化钠溶液中DNA的溶解度最小B.DNA遇二苯胺在沸水浴的条件下会变成蓝色C.DNA不溶于酒精而细胞中的一些物质
9、易溶于酒精D.质量浓度为0.1 g/mL的柠檬酸钠溶液具有抗凝血作用有关DNA粗提取的操作,错误的是A向溶解DNA的烧杯中加蒸馏水的目的是漂洗DNABDNA和杂质分子在95%的冷酒精中溶解度存在差异C提取植物细胞DNA时需在研钵中加入洗涤剂和氯化钠等试剂D提取动物细胞DNA时可用鸡血与蒸馏水混合后用玻璃棒搅拌 归纳总结1.鸡血细胞的DNA提取2.实验关键(1) 取材不用哺乳动物的血细胞( 由于成熟红细胞无细胞核)。(2)获取 DNA 时要向鸡血细胞液加入足量的蒸馏水,以便使细胞膜和核膜破裂,把核内物质释放出来。(3)实验中的搅拌,除最后一次搅拌外,其余搅拌均要朝一个方向。并且,在析出 DNA、
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