分子诊断技术在结核病诊治中的应用ppt课件.ppt
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1、分子诊断技术在结核病诊治中的应用,武汉大学人民医院检验医学中心 李 艳,全球结核病流行状况,WHO report,2013,全球结核病流行状况,全球结核感染人数2004年后处于下降趋势 HIV患者并发结核病数量处于平稳阶段 中国结核感染人数全球排名第二,WHO report,2013,全球结核病流行状况,WHO report,2013,全球结核病流行状况,全球结核死亡人数处于下降趋势 斯威士兰结核病感染率最高,WHO report,2013,全球结核病流行状况,Globally, an estimated 3.6% of new cases and 20.2% of previously tr
2、eated cases have MDR-TB There were an estimated 450,000 new cases of MDR-TB worldwide in 2012 On average, an estimated 9.6% of MDR-TB cases have XDR-TB,WHO report,2013,全球结核病流行状况,2012年全球新发结核病例为860万人,中国占总数的12% 在860万新病例中约110万人(13%)为HIV阳性,这些病例的75%在非洲 每年约有130万人死于结核病,我国为25万 结核病每24秒钟就杀死1人 预计未来20年还将有3600万人死
3、于结核病。 全球每年有45万新发MDR-TB,大约4.3万为 XDR-TB,“4多”,WHO report,2013,结核病诊治中存在的问题,预防问题,诊断问题,治疗问题,医疗问题,检验人员最关心的问题,根据不同分子水平及技术特点来选择诊断检测体系,方法选择,方法选择的影响因素,Sputum,涂片,MTB培养孵育4-8周 (阳性),药敏试验观察 孵 育4周观察生长情况,涂片 (阳性),分子诊断技术,液体培养及药敏试验,平均时间2-3个月,平均时间20天,只需2小时-2天,涂阳=60-98%有结核分枝杆菌,因此涂阳后最好用分子生物学方法进行快速鉴定,扩增 杂交,LAMP、SDA,芯片、RT-PC
4、R,SAT、TMA,FISH、Probe,分子诊断适宜技术的选择,T-SPOT.TB与 QFT-GI为IGRAs实验,结核菌素试验(TST),T-SPOT.TB,QuantiFERON-TB Gold in-tube (QFT-GI),蛋白质水平,全血IFN-释放分析技术(IGRA),结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞,效应T淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子(IFN-)。因此,检测效应T淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断。 由于效应T细胞存活时间很短,而且具有特异性,因此可以作为机体是否正处于被感染的指标,无论是否有临床症状。 基于IGRA原理的产品目前已被美国、加
5、拿大、英国、德国、意大利、瑞士、法国、荷兰、日本等二十余个国家写入本国的结核诊疗指南中,-干扰素释放实验,酶联免疫斑点技术,培养滤液蛋白10(CFP 10),早期抗原靶6(ESAT-6),一、T-SPOT技术基础,T-SPOT,由结核杆菌基因组RD1区相同的操纵子编码的蛋白 所有的卡介苗(BCG)均丢失该基因序列 绝大多数的环境分枝杆菌也不存在RD1区,结核杆菌特异抗原,ESAT-6与CFP 10抗原,Plama PBMCs Gel Barrier Erythrocytes,检测过程,分离PBMCs,加入PBMCs与结核特异抗原 37孵育16-20小时,PBMCs 特异抗原,-干扰素抗体,加入
6、标记二抗,孵育1小时,加入显色液,终止反应,观察结果:1个斑点=1个效应T细胞,结果判断图,阴性结果,阳性结果,空白对照 抗原 A ESAT-6 抗原 B CFP10 阳性对照 (PHA),潜伏性结核(LTBI)诊断技术比较,IGRAs与TST相比,具有更高的灵敏度和特异性 IGRAs与BCG, NTM无交叉反应,TST有交叉反应,难以从感染者中鉴别出活动性肺结核患者 小于5岁儿童、免疫力低下患者不适合采用IGRAs检测 试剂成本非常高,costs(费用) availability for clinicians and other health workers(医疗水平) patient ac
7、ceptability(患者是否接受) ease of distribution and storage(实验平台),核酸扩增技术,SAT:Simultaneous Amplification and Testing (RNA仁度) CPA: Cross Priming Amplification (DNA/RNA,优思达) LAMP:Loop-Mediated Isothermal Amplification (DNA, Japan) TMA: Transcription Mediated Amplification (RNA, Gen-Probe),GenoType MTBDRplus:(
8、Hain Lifescience) NASBA: Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (RNA,OT) RCA: Rolling Circle Amplification (DNA, Molecular Staging) HDA:Helicase-Dependant Amplification (DNA, Biohelix, NEB),RNA 拷贝数 DNA拷贝数,生命力旺盛的病原体RNA转录活跃,较好的愈后指标,交叉污染少,TMA、SAT优点,RNA作为临床分子诊断靶标,二、SAT技术,同一温度下(42),以RNA为起始模板,通过M-MLV反转
9、录酶产生一个双链DNA拷贝,然后利用T7 RNA多聚酶从DNA拷贝上产生多个(1001000个)RNA拷贝;每一个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环;同时,带有荧光标记的探针和这些RNA拷贝特异结合,产生荧光。该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获,直观反映扩增循环情况,TB-SAT操作步骤,阳性结果,阴性结果,恒温扩增 -42C RNA 检测 -起始靶标与扩增产物都是RNA 扩增产物的污染更少 -RNA环境中易降解 更高的扩增效率-30分钟内扩增10亿倍 反应稳定 - 抑制物少,高灵敏度、特异性 活菌检测 操作简单、快速,MTBDRsl-鉴定XDR,MTBDRplus-鉴定MDR,MTB
10、C-鉴定MTB复合群,MTBCM-鉴定MTB和NTM,分类,Gene-Probe(TMA/Hain)技术,三、MTBC-鉴定MTB复合群(TMA技术),方法名称: HPV(Hybridization Protection Assay)-杂交保护分析法为Gen-probe公司专利 原理: 以rRNA为靶标,采用线性探针技术检测结核分枝杆菌复合群 检测设备: LEADER 50i HPA-MTD(Mycobacterium Tuberculosis Direct): 2.5h 报告,直接从标本中检测结核菌 HPA-Accuprobe: 1h 报告,用菌落或自动培养系统的菌,样本,细胞溶解,目标 r
11、-RNA释放,MTD技术路线,杂交体,rRNA,60C 15分钟,加入探针,探针,杂交,选择性试剂,60C,化学发光读数仪,荧光检测,MTD技术特点,MTD结核分枝杆菌检测技术特点,采用分子技术快速鉴定(2.5小时)结核分枝杆菌复合群 标本可以是涂片阴性或者阳性的痰标本;也可以是培养物 唯一获得FDA推荐的凃阴样本快速检测技术 检测RNA,RNA只能来源于活的细菌,可鉴定活动性结核病人) 采用TMA恒温扩增,不使用PCR仪器,无需专业的PCR实验室认证 HPA杂交保护分析技术:灵敏、特异 严格的实验室防污染技术:整个实验过程所有试剂和样本全部在同一个反应管内进行,杜绝交叉污染,MTD结核分枝杆
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