培养基和试剂质量控制方法.ppt
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1、培养基和试剂质量控制方法 GB 4789.28-201X,北京陆桥技术有限责任公司 技术服务电话:0532-82689263 技术部邮箱: 销售服务电话:0532-82689263,主要内容,1、培养基简介,培养基 液体、半固体或固体形式的、含天然或合成成分,用于保证微生物繁殖(含或不含某类微生物的抑菌剂)、鉴定或保持其活力的物质。,1.1 定义,1、培养基简介,1.2.1 按组成成分分类 1.2.2 按状态分类 1.2.3 按用途分类 1.2.4 按制备方法分类,1.2 分类,1、培养基简介,1.2.1 按组成成分分类 纯化学培养基:仅含有已知分子结构和纯度的化学成分的培养基。 未定义和部分
2、定义的化学培养基:全部或部分由天然物质,加工过的物质或其他不纯的化学物质构成的培养基。,1、培养基简介,1.2.2 按状态分类 液体培养基:一种或多种成分组成的水溶液。如:脑心浸出液肉汤、营养肉汤; 半固体培养基和固体培养基:含一定量固化物(琼脂、明胶等)的液体培养基。 半固体培养基:含0.2%-0.8%琼脂粉,多用于细菌的动力观察、菌种传代保存及贮运细菌标本材料等。 固体培养基:含1.5%-2%琼脂,多用于细菌的分离、鉴定、菌种保存,1.2.3 按用途分类,1.2.4 按制备方法分类 即用型培养基:以即用形式或融化后即用形式置于容器内供应的液体、半固体和固体培养基 脱水合成培养基:使用前需加
3、水和进行处理的干燥培养基 自制培养基:依据完整配方的具体成份配制的培养基,1、培养基简介,2、培养基质量保证,质量保证培养基生产企业提供文件,标明培养基各种成分、添加成分名称及产品编号; 批号 培养基最终pH值 储藏信息和有效期 质控证书和测试菌株 性能测定结果及验收标准 必要的安全和/或危害数据,质量保证培养基使用者,每批培养基,应验收: 产品合格证明 包装的完整性 产品的有效期 生产企业文件的提供 记录接受日期,2、培养基质量保证,2.1 脱水合成培养基制备流程,2.2脱水合成培养基制备注意事项 概述:严格按照厂商提供的使用说明配置。 水:实验用水的电导率在25时不应超过25S/cm,相当
4、于电阻率0.4Mcm。 微生物污染103/mL,最好在102/mL以下;定期检查实验用水是否受到微生物污染。,2、培养基质量保证,2、培养基质量保证,2.2脱水合成培养基制备注意事项 pH值测定和调整: 使用pH计测定; 灭菌后冷却至25时测定pH值; pH值应在标准pH0.2范围内; 使用1mol/L的氢氧化钠或盐酸溶液调整培养基的pH值。 (如需灭菌后调整pH值,则使用灭菌溶液),2、培养基质量保证,灭菌方式: 湿热灭菌; 煮沸灭菌; 过滤除菌: 注意避免过度加热: 1.大容积(1000mL)时容易过度加热; 2. 放置物品太多或灭菌后未及时冷却。,2.2脱水合成培养基制备注意事项,SC正
5、常加热 SC过度加热,2.3脱水合成培养基使用注意事项 灭菌或复溶后培养基放入47-50的恒温水浴锅中,冷却保温,直至使用; 培养基只可复融一次,融化后的培养基应尽快使用,放置时间不应超过4小时,未使用完的培养基不能重新凝固留待下次使用。 个别培养基使用前需要脱氧:松开容器盖子,沸水浴或蒸气浴中加热15min,盖紧盖子,迅速冷却,如 FT培养基。,2、培养基质量保证,2、培养基质量保证,2.4菌株定义 标准菌株:至少定义到属或种水平的菌株,按菌株特性进行分类和描述,官方菌种保藏机构获得,最好来源于食品或水; 标准储备菌株:将实验室获得或供应商提供的标准菌株转接一代后得到的一套完全相同的独立菌株
6、; 储备菌株:从标准储备菌株转接第一代的培养物; 工作菌株:由标准储备菌株或储备菌株,或由经证明或未证明的标准物质转接一代获得的菌株,指在均一固定的浓度中含有具活性的定量化菌种, 经证明的标准物是指其浓度已经证明。,2、培养基质量保证,标准/质控菌株主要来源 美国菌种保藏中心 American Type Culture Collection Center,ATCC (英国)国家菌种保藏中心 (UK) National Center for Typical Culture Collection,NCTC 中国工业微生物菌种保藏管理中心 China Center for Industrial Cu
7、lture Collection ,CICC 中国医学微生物菌种保藏中心 China Center for Medical Culture Collection ,CMCC 注:陆桥均可代购以上菌株,ATCC菌株(进口),CMCC菌株(国产),注:ATCC菌株提供证书,可以自行到其网站下载。,2、培养基质量保证,2、培养基质量保证,标准菌株 (冻干菌种) 转种活化 标准储备菌株 (-80冰箱保存的培养物) 转种活化 储备菌株 (4冰箱保存的培养物) 转种活化 工作菌株 (用于培养基微生物质控的新鲜培养物),详细请参考附录C,通常悬浮于营养肉汤中 适宜时间进行复苏,验证菌落形态和革兰氏染色 或用
8、生化试验进行鉴定,例如:TSB添加10%-15% 甘油作为冷冻保护培养基,在不高于-70低温冷冻保存 可延长保存的时间。 禁止采用较高的温度保存。,此流程更合适,3、培养基质量要求,基本(感官和理化)要求:,分装的量和/或厚度 外观、色泽和均一性 琼脂凝胶的硬度 水分含量 20 -25 的pH值 缓冲能力,微生物要求:,微生物污染测试(只适用于即用型培养基) 生长特性 1、生长率 2、选择性 3、特异性 4、抗菌试验特性 注:详细参照GB 4789.28附录F培养基质量控制标准,性能评价和结果解释: 1、所有测试菌株的性能测试达到标准,则该批培养基的性能测试结果符合规定; 2、基本要求和微生物
9、要求均符合规定,则该批培养基可被接受。,质构仪,水分测定仪,电极式pH计,3、培养基质量要求,3、培养基质量要求,生长特性概述 a)定量方法; b)半定量方法; c)定性方法。 注:使用以上方法时,应使用参考培养基进行对照,有助于结果的解释。,选择近期批次中质量良好的, 或具有长期稳定性的批次培养基或即用型培养基,通常可满足实验室的培养基性能检测要求,培养基生产商 自制培养基 新培养基或新供应商产品 其他特殊要求,培养基性能测试第一法,4、培养基性能测试方法,4.1定量方法,悬浮培养基和运输培养基,非选择性固体分离和计数培养基,选择性固体分离和计数培养基,选择性固体分离和计数培养基,4.2半定
10、量方法,选择性液体增菌培养基,非选择性液体增菌培养基,选择性液体计数培养基,非选择性固体分离和计数培养基,4、培养基性能测试方法,选择性固体分离和计数培养基,4.3定性方法,Mueller Hinton血琼脂,鉴定培养基和实验试剂,悬浮培养基和运输培养基,非选择性固体分离和计数培养基,非选择性液体增菌培养基,选择性液体计数培养基,选择性液体增菌培养基,将适当稀释度的目标菌0.1mL分别涂布于待测培养基平板和参考培养基平板(可用螺旋平板法或倾注法),经培养后,计算PR。 PR = NS/NO PR:生长率; NS :待测培养基平板上得到的菌落总数; NO :参考培养基平板上获得的菌落总数,应10
11、0CFU。 结果解释: 非选择性培养基和选择性计数培养基上目标菌的生长率应不小于0.7; 选择性分离培养基上目标菌的生长一般不小于0.5,最低应为0.1。,接种水平为 20CFU200CFU,4.1 定量方法 非选择性、选择性固体计数和分离培养基,4、培养基性能测试方法,例:木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂(XLD) 测试菌株:鼠伤寒沙门氏菌,福氏志贺氏菌; 10倍稀释,选取适宜稀释度0.1mL涂布XLD平板和TSA参比平板,361培养 18h24h; 计数:,鼠伤寒沙门氏菌:,福氏志贺氏菌:,4.1 定量方法 非选择性、选择性固体计数和分离培养基,4、培养基性能测试方法,待测培养基分装试管,10mL/
12、支(或5mL/支); 目标菌浓度选择:100CFU1000CFU; 接种后,混匀: 立即吸取1mL,用相应培养基倾注平板; 剩余已接菌的待测培养基置2025放置45min,再吸取1mL用相应培养基倾注平板; 分别按标准方法中规定的培养条件培养后,计数; 结果观察与解释: 待测培养基中的菌落数变化应在50%内。,4、培养基性能测试方法,4.1 定量方法 悬浮培养基和运输培养基,制备106108CFU/mL 的工作菌悬液; 用1L接种环划线平板,A区用按0.5cm的间隔划四条平行线,按同样方法在B、C区划线,最后在D区划一条连续曲线; 培养后,评价菌落的形状、大小和生长密度,计算生长指数G; 每条
13、有菌生长的划线记为1分,如果仅一半的线有菌生长,记为0.5分,没有生长或生长量少于划线一半的,记为0分; 结果解释: 目标菌在培养基上应呈典型的生长,目标菌生长指数G大于6,培养基可接受;非选择培养基的G值通常较高。,4、培养基性能测试方法,4.2 半定量方法 非选择性、选择性固体计数和分离培养基,非目标菌半定量测试方法 用1L接种环划线平板,划六条平行直线; 每条有菌生长的划线记为1分,如果仅一半的线有菌生长,记为0.5分,没有生长或生长量少于划线一半的,记为0分; 结果解释 非目标菌的生长应部分或完全被抑制。,注:操作时用接种环而不用接种针,接种环完全浸入培养基中,取一满环接种物,接触容器
14、边缘3次,去除多余液体。划线时,接种环与琼脂表面的角度应为20-30,接种环压在琼脂表面的压力和划线速度前后一致,整个划线应快速连续,移取液体培养物时应将接种环伸入培养液下部分以防止环上产生气泡或泡沫。,4、培养基性能测试方法,4.2 半定量方法 选择性固体计数和分离培养基,培养基分装,10mL/支; 新鲜菌液10倍稀释后,选取10CFU100CFU稀释度工作菌悬液; 取1mL工作菌悬液接入待测培养基; 同时取1mL倾注平板,做接种量计数用; 按标准方法中的培养时间和温度进行培养(如增菌时间为8h以下,取10L增菌液倾注平板,再按适合的时间和温度培养,结果按附录F判定); 结果解释: 0 表示
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