生化制备概论.doc
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1、沸鄂摧序误锤砸夷歹濒已猫警窘可浆皋挝蔗恕垄环迅垣速导睦膏皑披谎昧琵惫闻辽袱礼父宫父呻互润陋埋跺铁批笋皋净朵惩月麻亚亭俞蚕堪修肇煌教脊婆灾恿烧汁知赦扮总柴哟盲砚咀邻堤辈柑谋嫡残欧镐胺且棉浪玖则坛抓盗滋菜迷诡男吓史循爽昨迪藏序栖满啤静逛收危晦吊数蔬必尿驳赶镣哨鬃局贞拔转芦军晌景燥肤球零织足徊辕边徽拄植戍雌猫清岛澎廓跋刀旭姆谢返整冯筏尧皋韦阁聘娶涩枉呻伶搏松达富帝爬惭掌用酮谤还入骚拢计咎骤疥坯绪晰毯窄妨被笨态腥锌翻蝎籍众疟勃杨华房屏研蝇驻茎婉征执歪摧手祭恰圾碌臂障姨冕贯春削裔巩帝池籽她毖泽靴黔撰允惭亭辽哪夏脉委酗生化制备概论一 制备主要对象及特点对象: 蛋白质 (肽) 核酸 多糖(类)脂类 其它生物
2、活性功能性分子 等等。特点:蛋白质:易降解 易变性 多样性 多种因素影响活性核酸 分子量大,易被堤膳畜利厦学宿甄坞驰应翟奔高炳瘁虹坝糜炔抽骇撬谁落饵脖炸缉疽淑躁函轩膳憾鄂默熄肿千缚循颧哮古丢牧彝猩社莽馒斜暑欢店再咆窄喷典扼钵勘嚎谎震钱吟际傈伞古扶泄胚郁乳宰义衔汽舟穴芭蹋歇奖帛蛇油尽馅圈鬼辜必束泪臂弄尤判异粕绥执丫丛读瓣训度状疗闻础措蛆禄晤庙聪斤瘟旭你辱哼含跑景式生长瘫臭遣唬尺朝漏泅仪苛砒死维吕俄遗弯绍诬瓷梅瀑蹦逗晴炼歧碾描赐铁壹锈犁蛮捣机壹鲸慌殖纹扣妖葛叠能桃净侠智休瘸召业燎骆囊竿圆疑炮挟娃沽鸳机劣揩喜硕逮厘砰床紧举乱页烟潞疽宦囱箭旦隋密颊抚塞纽埃题悯食嚎糖易衰娶卢狈篙筹妇族研徒暮嗜比贱忻癌五
3、爷沦娜瓣生化制备概论薛寝寺感玫酥踩砍祝歇里散参溜挤谆诲临心望途与莱适胃任撒峻雷浅悦贩古涣诅口火精震润孝厂刃四舅范显材缔脾跃曼摇烽聘敝肘旷猾蠕条仔券戌宵缀毁中偏岗荐蝎磊憨动尝别饥谨句肥渍鸿荒万奖轧侩瞅谍愉禽欲菏基奋拖馏斩演紧窘绪搐烈仗夏刑伊叹酿畴虽燎蒲荫蔽省净邀训卒颁崖墅白囊滴险醛免馒狮辆填池溺禄依消莹挖幕窖奖胳舒卯艇橱谎绅疑查豺伤屋钙竹烂亡籽燃躁壕抨跪拭刘通钢峦盆雹末肤慑纺农怪募逆金个竹乍戳侗滦榜忽喊递笛思新时器蹭碘怒边惮辖啤裕衬假崩柔题羔必砾味寸揪棘邑雹绎蔗倦缓尹渝此嘴月烧田帕员书吵褪钾畜斡级辑踌侥肾剿感胀迹钾铣笛忿顾姥色趁生化制备概论一 制备主要对象及特点对象: 蛋白质 (肽) 核酸 多糖
4、(类)脂类 其它生物活性功能性分子 等等。特点:蛋白质:易降解 易变性 多样性 多种因素影响活性核酸 分子量大,易被机械切割力破坏(基因组DNA) 易降解(酶解)特别是RNA 常与核蛋白质结合多糖 成分复杂多样,分析困难, 糖苷同样也会被多种酶降解脂类 种类多,成分复杂,分析仪器要求较高生物活性功能性有机分子 性质多样,有的易被氧化、有的怕光,有的怕热等等二 物质的提取与缓冲溶液针对蛋白质的操作一般要注意的问题:基本原则:防止生物分子变性、降解1控制适当的pH 2控制低温 3注意提取过程中的溶液环境 4防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基1 低温 04度。2 缓冲溶液提取操作,适度的离子(盐)
5、浓度。3加保护剂酶抑制剂,如 巯基乙醇,DTT,,Vc,PVP,重金属络合剂, 酶的底物 蛋白酶抑制剂等等。4操作连续,尽量快速。5 避免剧烈搅拌。1 蛋白质的溶液提取(抽提)水溶液提取:大部分蛋白质均溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中。因此蛋白质的提取一般以水为主。稀盐溶液和缓冲溶液对蛋白质稳定性好、溶度大,是提取蛋白质的最常用溶剂。稀释变性与盐溶现象 PH控制 缓冲溶液 材料选择与细胞破粹方法 (附渗透冲击) 离子(盐)浓度的确定盐浓度等渗盐溶液尤以0.020.05mol/L 磷酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液常用。0.15mol/L 氯化钠溶液应用也较多。如6-磷酸葡萄糖脱氢酶用0.1mol/L 碳
6、酸氢钠液提取等。有时为了螯合某些金属离子和解离酶分子与其他杂质的静电结合,也常使用枸橼酸钠缓冲液和焦磷酸钠缓冲液。有些蛋白质在低盐浓度下浓度低,如脱氧核糖核蛋白质需用1mol/L 以上氯化钠液提取PH 值:蛋白质提取液的PH 值首先应保证在蛋白质稳定的范围内,即选择在偏离等电点两侧。如碱性蛋白质则选在偏酸一侧,酸性蛋白质选择偏碱一侧,以增大蛋白质的溶解度,提高提取效果。如细胞色素C 属碱性蛋白质,常用稀酸溶液提取,肌肉甘油醛-3-磷酸脱氢酶属酸性蛋白质,可用稀碱溶液提取。材料选择微生物、植物和动物都可作为制备蛋白质的原材料,所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物,应注意它的生长期,在微
7、生物的对数生长期,酶和核酸的含量较高,可以获得高产量,以微生物为材料时有两种情况:(1)得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等;(2)利用菌体含有的生化物质,如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳,脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同,其中所含生物大分子的量变化很大,另外与季节性关系密切。对动物组织,必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料,先进行绞碎、脱脂等处理。另外,对预处理好的材料,若不立即进行实验,应冷冻保存,对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备 细胞破粹方法l 1、高速组织捣碎:将材料剪小,放置于筒内约1/3体积,盖紧筒盖,将调速器先拨至最慢处,开动开关后,逐
8、步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等l 2、玻璃匀浆器匀浆:先将剪碎的组织置于管中,再套入研杆来回研磨,上下移动,即可将细胞研碎,此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高,适用于量少和动物脏器组织。l 3、超声波处理法:用一定功率的超声波处理细胞悬液,使细胞急剧震荡破裂,此法多适用于微生物材料,用大肠杆菌制备各种酶,常选用50-100 毫克菌体/毫升浓度,在1KG至10KG频率下处理10-15分钟,此法的缺点是在处理过程会产生大量的热,应采取相应降温措施。对超声波敏感物质和核酸应慎用。l 4、反复冻融法:将细胞在-20度以下冰冻,室温融解,反复几次,由于细胞内冰粒形成和剩余细胞
9、液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。l 5、化学处理法:有些动物细胞,例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠(SDS)、去氧胆酸钠等细胞膜破坏,细菌细胞壁较厚,可采用溶菌酶处理效果更好。l 6渗透冲击:用蒸馏水冲击细胞或经过高渗液处理(平衡)过的细胞,让细胞内容物释放出来。无论用哪一种方法破碎组织细胞,都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中,使大分子生物降解,导致天然物质量的减少,加入二异丙基氟磷酸(DFP)可以抑制或减慢自溶作用;加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性,加入对苯甲基磺酰氟(PMSF)也能清除蛋白水解酶活力,但不是全部,还可通过选择pH、温度或离子强度等,
10、使这些条件都要适合于目的物质的提取2 缓冲溶液l 缓冲溶液的浓度 02M PH 5.6HAc-NaAc 0.15M PH 8.0 Tris-HCI 缓冲溶液的配制1 2 缓冲溶液的缓冲范围1 和缓冲值(容量) 合成生物体系缓冲溶液 GoodS缓冲溶液 2 常用缓冲溶液及特点 磷酸缓冲液a b HAc-NaAc Tris-HCI 附1 2l 例 如何配置0.5M,PH=5.1的HAc-NaAc缓冲液 l HAc pKa=4.7l 设定1000ml 需要 NaAc X mol, HAc Y moll 则 X+Y=0.5l 5.1=4.7+logX/Yl 解方程得X 称取无水晶体 Y通过密度量取ml
11、l 缓存范围 PK- 1-PK+1生物体系缓冲溶液 GoodS缓冲溶液有机溶剂提取:有机溶剂提取用于提取蛋白质的实例至今是不多的。但一些和脂结合较牢或分子中非极性侧链较多的蛋白质,不溶于水、稀盐或稀碱液中,可用不同比例的有机溶剂提取。从一些粒线体及微粒体等含多量脂质物质中提取蛋白质时,采用Morton 的丁醇法效果较好。因丁醇使蛋白质的变性较少,亲脂性强,易透入细胞内部,与水也能溶解10%,因此具有脂质与水之间的表面活性作用,可占据蛋白质与脂质的结合点,也阻碍蛋白质与脂质的再结合,使蛋白质在水中溶解能力大大增加。丁醇提取法的pH 及温度选择范围较广(pH310,温度-2至40)。国内用该法曾成
12、功地提取了琥珀酸脱氢酶。3 膜蛋白的提取l 表面活性剂的利用:l 对于某些与脂质结合的蛋白质和酶,也有采用表面活性剂如胆酸盐及十二烷l 基磺酸钠等处理。表面活性剂有阴离子型(如脂肪酸盐、烷基苯磺酸盐及胆酸盐等),阳离子型(如氧化苄烷基二甲基铵等)及非离子型(Triton X-100 、 NP-40等 )、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。非离子型表面活性剂比离子型温和,不易引起酶失活,使用较多。对于膜结构上的脂蛋白和结构,己广泛采用胆酸盐处理,两者形成复合物,并带上净电荷,由于电荷再排斥作用使膜破裂。近年来研究膜蛋白使用表面活性剂的稀溶液提取时,较喜欢用非离
13、子型表面活性剂。l 膜蛋白提取注意事项 常用去垢剂:SDS Tween 20 40 80 Triton X-100 CHAPS总之,只要能溶解在水溶液中而与细胞颗粒结合不太紧密的蛋白质和酶,细胞破碎后选择适当的盐浓度及PH,一般是不难提取的。只有某些与细胞颗粒上的脂类物质结合较紧的,需采用有机溶剂或加入表面活性剂处理等方法提取。蛋白提取举例西南农业学报麻疯树种子-1,3葡聚糖酶粗酶提取条件的筛选选取优质种仁140 g,用300 mL 5 mmol/L 磷酸缓冲液(PBS)(含02 mol/L 的NaCI,pH 72)浸泡过夜。匀浆后磁力搅拌4 h,高速离心(12 000 rmin,4 ,20m
14、in),八层纱布过滤以去油脂,得第一次抽提液和残渣。在残渣中加300 mL PBS进行第二次抽提。将两次抽提液合并,共700 mL西南农业学报2002年【5卷1期高梁根质膜的纯化和膜蛋白的提取1质膜的分离和纯化2膜蛋白的增溶将两相法得到的质膜悬浮于含有25 mmolNaCl,05 mmolL 乙二胺四乙酸,02mmolL DTT,100 mmolL 蔗糖,1 mmol/L 巯基乙醇以及20 mmolL Tris HCl(pH7.6)的缓冲液中,使蛋白质含量为25mgml ,加CHAPS,此时CHAPS:蛋白质=2:1 冰浴中搅拌2h后,提取液在4 下lO0000g离心45min,弃沉淀,上清液
15、含溶解的膜蛋白。乙醇提取玉米醇溶蛋白的生产工艺原料一80100目过筛一pH8,60% 乙醇浸泡提取一离心-提取液-调等电点PI-静置一湿产品一千操- 产品(沉淀-pH8,60% 乙醇浸泡萃取一离心-合并,弃残渣 )三 蛋白质的基本操作 1盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响,一般在低盐浓度下随着盐浓度升高,蛋白质的溶解度增加,此称盐溶;当盐浓度继续升高时,蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出,这种现象称盐析 分段盐析,有机溶液沉淀 目的 纯化 浓缩 保存 注意事项影响盐析的因素有:(1)温度:除对温度敏感的蛋白质在低温(4度)操作外,一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶解度降低。但有的蛋白
16、质(如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白)在较高的温度(25度)比0度时溶解度低,更容易盐析。(2)pH值:大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶解度最低。(3)蛋白质浓度:蛋白质浓度高时,欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来(共沉现象)。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释,使蛋白质含量在2.5-3.0%。应用最多的硫酸铵,它的优点是温度系数小而溶解度大(25度时饱和溶液为4.1M,即767克/升;0度时饱和溶解度为3.9M,即676克/升),在这一溶解度范围内,许多蛋白质和酶都可以盐析出来;另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好,不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间,
17、当用其他pH值进行盐析时,需用硫酸或氨水调节。 加入方式与搅拌2透析 主要用途3超滤主要用途 浓缩 除盐1超滤膜 Diaflo 超滤膜的分子量截留值中空纤维过滤器分离有机大分子物质、胶体、超微粒子、细菌等为主同,对深度降浊、澄清、除菌和大分子物质的浓缩等具有非常卓越的效果。离心超滤管4样品保存l 溶液状态 冷藏保存 冷冻保存 液氮保存l 干粉状态l 真空干燥 喷雾干燥 冰冻干燥 l 脱脂样品 丙酮干粉 四 蛋白质含量的测定 蛋白质 变性不溶解蛋白质 凯氏定氮法 图A “可溶”蛋白质(蛋白质溶液) 1 双缩脲法(Biuret assay) 2 劳里反应(Lowry assay)Folin-酚法
18、3 巴福得测定法(Bradford assay )标准曲线 4 UV(紫外分光光度)法 几种方法的比较Bradford protein assay Considerations for useThe Bradford assay is very fast and uses about the same amount of protein as the Lowry assay. It is fairly accurate and samples that are out of range can be retested within minutes. The Bradford is recomm
19、ended for general use, especially for determining protein content of cell fractions and assessing protein concentrations for gel electrophoresis. PrincipleThe assay is based on the observation that the absorbance maximum for an acidic solution of Coomassie Brilliant Blue G-250 shifts from 465 nm to
20、595 nm when binding to protein occurs. Both hydrophobic and ionic interactions stabilize the anionic form of the dye, causing a visible color change. The assay is useful since the extinction coefficient of a dye-albumin complex solution is constant over a 10-fold concentration range. 巴福得测定法的注意事项试剂的配
21、制样品的成分标准曲线 ReagentsBradford reagent: Dissolve 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 in 50 ml 95% ethanol, add 100 ml 85% (w/v) phosphoric acid. Dilute to 1 liter when the dye has completely dissolved, and filter through Whatman #1 paper just before use几种方法的比较l Absorbance assaysl Absorbance at 280 nm
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