BDNF, TrkB 在岛叶慢性电点燃大鼠海马中的表达及与学习记忆的关系.doc
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1、 BDNF、TrkB 在岛叶慢性电点燃大鼠海马中的表达及与学习记忆的关系 徐文中 王峰 张培松 任双来 齐江华 孙涛* 收稿日期:2010-09-17 基金项目:国家自然科学基金资助(30750014);宁夏自然科学基金资助( NZ09114) 通信作者:孙涛, E-mail:(宁夏医科大学,宁夏回族自治区颅脑疾病重点实验室,银川750004)摘要: 目的 研究岛叶慢性电点燃癫痫模型大鼠的学习记忆功能,检测脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、酪氨酸蛋白激酶受体B(Tyrosine receptor kinase B,TrkB)在海
2、马组织中表达,探讨BDNF、TRKB与岛叶点燃大鼠学习记忆的关系。方法 成年SD大鼠随机分为模型组、假手术组、空白对照组,建立大鼠岛叶慢性电点燃模型。用避暗试验方法检测岛叶慢性电点燃模型大鼠学习记忆功能,采用免疫组化和western blot方法分别检测BDNF、TrkB蛋白在海马组织中表达水平,用RT-PCR检测两因子基因表达水平。结果 岛叶慢性电刺激点燃成功后第1天(即0周),学习记忆能力点燃组与空白对照组、假手术组差异无统计学意义 (P0.05)。点燃2周点燃组避暗试验结果的LT为(48.873.42s)、EN为(2.750.99次)、点燃3周点燃组避暗试验结果的LT为(48.712.7
3、7s)、EN为(2.751.15次),与对照组(即点燃0周)相比学习记忆功能增强(P0.05),点燃4周后与对照组比学习记忆功能明显下降(P0.05)。BDNF、TrkB表达均在24h达到高峰(P0.05),空白对照组、假手术组无明显变化。组内比较,峰值及增幅均出现在23周内(P0.01),4周后较前几周组明显下降(P0.05)。结论 岛叶电点燃大鼠学习记忆功能与BDNF、TrkB在海马中表达总变化趋势一致。BDNF、TrkB与岛叶点燃大鼠学习记忆功能密切相关。关键词:岛叶;癫痫;BDNF;TRKB;海马;避暗试验;学习记忆中图分类号: 文献标识码:A The expression of BD
4、NF and TrkB in rat hippocampus and the relationship with learning-remembering ability in chronic electronic ignition of insular lobe.XU Wen-zhong , WANG Feng, ZHANG Pei-song ,REN Shuang-lai,QI Jiang-hua,SUN Tao. Ningxia Medical University,Key Lab of Craniocerbral Disease, NingXia Hui Autonomous Regi
5、on,Yinchuan 750004,ChinaCorresponding author:SUN Tao,Email:. 【Abstract】Objective To study the expression of active Skeleton Adjustment Protein(BDNF、TrkB) in rats Hippocampus in the model of insular chronic electricity-igniting epilepsy and investigate the relation between BDNF、TrkB and learning-reme
6、mbering ability in the epileptic rat.Methods: To divide adult SD rats randomly into model, sham and control group, respectively. The Passive avoidance test was employed to test learning-remembering ability of rats and Immunohistochemistry and western blot was used to determine the expression of BDNF
7、、TrkB in the hippocampus and RT-PCR was exploited to check the gene expression of the two factors.Result: There is no big difference of learning-remembering ability of rats among the igniting group or control group and sham groups ( P0.05) in the first week after insular chronic ignition when passiv
8、e avoidance test was examined. The increased learning-remembering ability appeared in the 2nd week (LT: 48.873.42s;EN: 2.750.99),3rd week(LT:48.712.77s;EN:2.751.15) after the ignition(P0.05).It was declined in the 4th week. As for the expression of BDNF and TrkB the peak value occurred in the 24 hou
9、rs (P0.05). Conclusion: The general tendency of the expression of BDNF、TrkB in rat hippocampus after the chronic insular electricity ignition was consistent with the learning-remembering ability of epilepsy rats. BDNF and TrkB are closely associated with the learning-remember ability for epilepsy ra
10、ts.Key words: Insula, epilepsy, BDNF、TrkB, hippocampus, learning and remembering ability, Passive avoidance test癫痫是中枢神经系统功能失常脑科临床综合征,可引起认知功能损害。2008年Bekinschtein P等研究发现脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor BDNF)及其特定受体酪氨酸蛋白激酶受体B(Tyrosine receptor kinase B,TrkB)在癫痫的学习记忆中起到重要的作用,并将持久的记忆储存海马1-3,但机制
11、尚不明确。作为人类第五脑叶的岛叶,对记忆、学习起着至关重要的作用3-5。本研究应用避暗实验检测岛叶癫痫大鼠学习记忆功能,检测BNDF、TrkB在其海马中表达,探讨BDNF、TrkB在岛叶癫痫大鼠学习记忆的作用,初步了解岛叶起源癫痫引起认知损害的机制。1 材料与方法11 主要试剂 实验用抗体羊抗兔抗BDNF、TrkB购自SANTA CRUZ公司,蛋白实验用试剂盒均购自南京凯基生物有限公司。硝纤膜及ECL发光试剂盒购自PIECE公司。RT-RCR试验用试剂盒购自上海生物工程公司。 1.2 实验动物及分组 健康68周SD雄性大鼠180只,体重(22515)g,由宁夏医科大学动物中心提供,随机分为:岛
12、叶点燃组、岛叶假手术组、空白对照组。点燃组再分为:0周(从点燃当天到点燃6d)、1周、2周、3周、4周等亚组。每亚组再取1h、12h、24h时间点检测。模型点燃成功率为92.3%,模型成功率与大鼠体重未见相关性(P0.05)。每组大鼠n=6只1.3 模型制作 大鼠麻醉后,固定于SR-5R型脑立体定向仪,正中切口,以前囟为参考点;于枕、额骨区安放加固螺钉3个,螺钉兼做接地电极;参考Paxinos & Watson图谱(左侧岛叶:前囟前1.2mm,旁开5.5mm,硬膜下5.5mm),本实验电极置于左侧岛叶(电极植入左右侧差异性无相关文献报道),定向仪辅助下,垂直植入电极,恢复7d进行后续试验。后放
13、电阈值(ADT):单通道刺激器AM-2100型电子刺激器进行刺激,Alpha-Lab 4通道信号采集及处理系统记录大鼠脑电活动,刺激强度由 90A开始,每次增加20A,间隔3min,直至出现3s以上的皮层电流,此强度即为ADT。从测定ADT的第1天起,每日刺激两次,强度为ADT的1.5倍,同时观察大鼠脑电变化且记录发作强度。癫痫发作强度按Racine分级评分。连续出现5次5级发作即为点燃成功1。点燃后大鼠会出现自发癫痫发作,但在点燃后长时间(约1月)不受任何刺激下,不再出现癫痫发作,这是模型局限性。为了保持模型是癫痫鼠状态,在点燃后1周、2周、3周、4周同一时间点分别给予一次ADT的1.5倍刺
14、激,使其5级发作一次。假手术组只植入电极,不行电刺激。1.4避暗试验 全部大鼠均采用避暗试验法进行学习记忆能力测试。大鼠在实验箱内适应2 min,实验箱分明、暗两室,两室间有一直径10cm的圆孔,暗室底部有可通电铜栅。将大鼠背对暗室的洞口放入明室,并开始计时,大鼠很快进入暗室,此时接通暗室电源,给予直流电电击大鼠,其会逃出暗室,训练5 min。24 h后,在暗室铜栅通电的情况下,将动物置于明室,记录大鼠从明室第1次进入暗室的时间为潜伏期(LT),然后记录10min大鼠进入暗室的次数即穿梭次数(EN),LT和EN共同作为记忆成绩。1.5标本收集 大鼠单笼饲养,避暗试验后用乙醚麻醉后一部分断头迅速
15、取出海马组织,至-80冰箱以备用,另一部分用4%多聚甲醛灌注后取全脑放于蔗糖溶液梯度脱水,应用OTC(Sakura, USA)包埋,-80冰箱保存以备组织切片用。1.6免疫组化检测 采用SABC免疫组化法,兔抗鼠BDNF(1:50)、兔抗鼠TrkB(1:75),二抗(1:600),常规免疫组化操作,检测海马中BDNF、TRKB表达,应用KS400图像分析系统进行定量分析,每张切片随机取6个中倍视野,取阳性细胞百分率。1.7 RT-PCR检测mRNA表达 应用Trizol试剂常规一步法提取海马组织的总RNA,逆转录合成cDNA。 参照文献和核对得到PCR特异性引物。引物合成有上海生工合成,逆转录
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