Pro-inflammatory cytokinechemokine production1.doc
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1、呼肠病毒是一种双链RNA病毒nonenveloped是在人口高度流行但产生一些临床症状。大的兴趣,包围了呼肠孤病毒作为一种溶瘤代理,因为它能够感染和诱导肿瘤范围的人类正常细胞死亡,而保留使用。此外呼肠孤病毒已完成了早期临床试验的次数,也是目前在第三阶段的测试设置。初步研究表明,肿瘤特异性溶瘤活性后,激活的Ras信号通路的存在有关,尽管最近的数据表明,易感性呼肠孤病毒感染可能会影响其他复杂的机制 本实验室以前的工作表明,人类黑色素瘤细胞系,以及新鲜手术切除肿瘤,进行呼肠孤病毒引起的一Ras/RalGEF/p38依赖性细胞死亡,而这种死亡是由炎性趋化因子和细胞因子释放的陪同下。的炎症介质的释放以下
2、病毒感染肿瘤细胞已被观察到,如单纯疱疹病毒(HSV)8和新城疫病毒(NDV)其他溶瘤病毒。和不论是自然或通过诱导免疫激活基因直接插入溶瘤,一些病毒,已被证明,以刺激抗肿瘤免疫反应,表明其潜在的免疫治疗和细胞毒性药物。我们以前曾表明,呼肠孤病毒可以通过直接激活施加直流先天刺激NK / T细胞对肿瘤细胞免疫细胞毒性作用,并呼肠孤病毒诱导肿瘤细胞死亡促进先天免疫和适应性抗肿瘤反应在小鼠和人体模型吸系统。然而,由呼肠孤病毒感染的黑色素瘤细胞(病毒本身可迅速清除体内的影响独立)产生的促炎症环境的免疫原性,在发起细胞因子/趋化因子在肿瘤细胞中参与制作的信号通路,还没有得到解决。趋化因子可以在感染和炎症参与
3、由指挥免疫在宿主反应效应细胞迁移。趋化因子的四个家庭被描述的基础上,保守的半胱氨酸残基的位置。多趋化因子受体可以共享一个共同的,每个趋化因子有可能绑定到几个不同的受体,从而使多种生物的成果后,趋化因子和环境构成的细胞内环境而定。此外,在炎症部位,趋化因子能形成heteromers,有可能诱导协同行动,增强白细胞的迁移和活化。因此,在一个多趋化因子诱导免疫抑制肿瘤微环境有可能诱发免疫效应细胞,以提高治疗效果有力。例如,在小鼠黑色素瘤模型,异位表达和肿瘤细胞的IP- 10分泌增加在肿瘤部位和延长生存依赖NK细胞的NK细胞的数量。数据还显示之间CXCR3表达对T细胞和改进的第三阶段黑色素瘤患者的临床
4、疗效较好的相关性。目前的研究进一步探讨趋化因子和细胞因子(包括I型干扰素)的reoviral溶瘤诱导的信号通路,为这些炎症介质的产生负责。我们还确定具体的活动性病毒缺乏reoTCM的影响,以排除病毒免疫激活对趋化,NK细胞,DC和CTL的激活和效应功能,直接的后果。材料和方法细胞培养和呼肠孤病毒Skmel - 28、Mel- 624、Mel- 888和MeWo细胞生长在Dulbecco的改良Eagle培养基(DMEM培养基)(Invitrogen公司,佩斯利,英国),加入10(体积/ V)的胎牛血清(FCS)的(BioSera,帕特里克下,英国)和1(v / V)L -谷氨酰胺(Sigma A
5、ldrich公司)。获得外周血液单个核细胞(PBMC),经当地伦理学批准,采用Ficoll - Hypaque密度梯度离心从健康献血者棕黄色大衣。人类骨髓未成熟树突状细胞(DC)产生的人类PBMC经MACS CD14 +选择(Miltenyi公司生物技术)或者单核细胞粘附,如前所述。单核细胞培养在RPMI 1640培养基中,加入10胎牛血清,1L -谷氨酰胺(完整的媒体),800 U / ml的GM - CSF的和500 U / ml的IL - 4的,培养5天。使用MACS negative depletion kits从人类PBMC中分离得到NK细胞(90纯度) 。NK细胞常规培养于DMEM
6、,10(体积/ V)的人AB血清、5(体积/ V)的胎牛血清和1(v / V选择)L -谷氨酰胺的。用病毒感染Mel- 888细胞(moi 0.1),以如下方法详细分析得知,14天后产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。对于趋化实验,NK细胞、DC和CTL的悬浮于RPMI/0.5的人AB / 1 LGlutamine 中。所有细胞株生长在37,含5二氧化碳条件下,并定期检查,证实无支原体存在。另有说明黑色素瘤细胞用2.5mM 2 -氨基嘌呤(2 -美联社)或50M的咖啡酸苯酯(CAPE)处理1小时之前,期间,与呼肠孤病毒治疗。无论是2 - AP,还是CAPE,都没有在使用的剂量凯普直接黑色素瘤细胞
7、毒性(数据未显 示)。迪林呼肠孤病毒3型菌株生物技术公司是由Oncolytics提供的病毒滴度测定用标准的牌匾L929细胞检测。酶联免疫吸附试验,点阵仪和流式细胞仪使用配对抗体检测IL - 8。IFN-的检测使用IFN- kit。趋化因子和IP- 10的检测采用点阵仪检测技术(Biosource)。为了评估NK细胞表型的活化作用,以CD69-APC/CD56-PE/CD3PerCP抗体标记NK细胞(屋宇署Pharmingen公司,R和D系统)。用FACS-Calibur仪器,以CD56-PE+ve/CD3-PerCP-ve populations确定CD69的表达。免疫印迹Western Bl
8、otting黑色素瘤细胞株接种于10厘米的菜肴和未经处理或离开四呼肠病毒感染与10pfu/cell,8,12,16,20和24小时以前,向全细胞裂解物的准备。准备使用核分数主动母题核提取试剂盒根据制造商鈥指示。全细胞裂解液准备使用RIPA缓冲与蛋白酶抑制剂的鸡尾酒(25渭升/毫升,sigma)的补充。 10渭总加载每克蛋白质的全细胞裂解液为巷。 20渭加载G蛋白每核分数线。分离蛋白,10的聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素膜。对膜进行探讨与总巴基斯坦卢比(蓝光转导实验室),我- B型(圣克鲁斯)和p65核因子- B型(上州)抗体。抗体结合使用奥德赛检测系统(李西科生物科学英国,剑桥,英国)。平等巷
9、装载证实使用针对-肌动蛋白(Sigma公司)单克隆抗体。RNA干扰(RNAi)技术研究购自Ambion公司的siRNA和重组,以20M浓度根据制造商的指示。是对巴基斯坦卢比(PKRV)和无关(绿色荧光蛋白专用)对照siRNA的siRNA寡核苷酸被使用。该序列,PKRV5AAGGUGAAGGUAGAUCAAAGA-3,控制5AAGGACGACGGAAACUACAAG-3。黑色素瘤在24孔板和10 cm菜细胞,转染100纳米(这是由初始浓度滴定实验优化)的siRNA。对照siRNA转染浓度相当于使用包括在每个实验。转染,进行了血清免费使用6小时OligofectAMINE(Invitrogen公司
10、)媒体。媒体得到了补充和补充,并与血清中细胞的siRNA过夜培养的继续存在。隔夜培养后预先存在的媒体被排除在24孔板和一毫升正常生长介质取代,细胞不及时治疗或呼肠孤病毒(0-10pfu/cell)感染。从这些细胞上清在24和48小时呼肠病毒感染。对于10厘米菜前被拆除现有的媒体和全细胞裂解液的制备和SDS - PAGE电泳前总巴基斯坦卢比抗体探测分开。平等巷装载证实使用针对-肌动蛋白的单克隆抗体。引发的MEL -888细胞毒(CTL)的T淋巴细胞梅尔- 888细胞接种于培养瓶中,并允许组织坚持。直流,悬浮在媒体50:50的直流混合/ reoTCM(由梅尔- 888),非reoTCM,或直流媒体
11、/ DMEM培养完成,增加了在1:3(DC到梅尔- 888细胞:肿瘤细胞)过夜。悬浮细胞,吸气,使肿瘤的单分子层完整,细胞颗粒如前所述。肿瘤直流,然后装在CTL媒体悬浮的RPMI与7.5(v / V选择)人AB血清(Sigma公司),1(v / V选择)L -谷氨酰胺,1(v / V选择),丙酮酸钠(生命技术为辅),1(v / V选择)非必要的氨基酸(生命技术),1(体积/ v)的培养基含(生命技术),20mol/ L的2 -巯基乙醇(Sigma公司),和混合的比例在1:10至1:30自体外周血单个核细胞。文化中分别添加5毫微克/毫升的IL -7(研发系统)由第1天,30天4只/毫升的IL -
12、2(研发系统)。文化被重新刺激的7天使用相同的协议。细胞收获第14天,铬释放,CD107细胞脱颗粒和干扰素- G的评估,详情如下。NK细胞,DC和CTL的趋1.5 105个黑色素瘤细胞接种于6孔板和左过夜。前被拆除现有的媒体的DMEM / 2/ 1L -谷氨酰胺和细胞用1或10pfu/cell 48小时呼肠病毒感染的现场总线所取代。收集上清通过0.2微米Acrodisc注射器过滤器(颇尔生命科学版),然后通过ViresolveNFR过滤器(纯水)删除病毒。趋化评估采用Transwell小系统650L的过滤中医从四个黑色素瘤各细胞株添加到下腔一式三份在24孔板中井和一个5微米(NK细胞和CTL)
13、或8微米(直流)Thincert膜(格雷纳生物之一)在有条件。5 105 NK细胞,直流或CTL(反梅尔- 888的CTL,这些趋化实验中使用了以前使用引呼肠病毒感染的梅尔- 888负载DC的描述12),在100l的低血清培养基悬浮被安置在上院和板分别在37孵育3小时C。在较低的井收集细胞,在流式细胞仪缓冲洗净,用3L的CD56的,聚乙烯(Serotec)和标记3微升外周血CD3 - FITC标记(蓝光生物科学)(NK细胞),素CD11c -聚乙烯(蓝光生物科学)(DC)或3微升外周血CD3 - FITC标记和CD8 - PerCP(CTL)的30分钟在4 C细胞洗涤,悬浮于300L的缓冲区和
14、流式细胞仪转移到超铀数管(屋宇署Biosciences公司),其中包含一个已知数量的荧光珠,提供内部计数控制。A至珠细胞比例确定每个管和一个迁移指数是由这个比例正常化的对照组中,中医收获感染肿瘤细胞(nonreoTCM)被用来计算。CD107细胞脱颗粒和干扰素- G的染色CD107是一种溶酶体颗粒胞吐的标记,并作为一种NK细胞和CTL细胞脱颗粒标记如前所述14使用。 NK细胞和CTL孵育在与肿瘤的目标(K562细胞,梅尔-888或卵巢癌SKOV- 3)按1:1的比例,在CD107a- FITC和CD107b- FITC标记抗体(屋宇署生命科学)的存在。布雷菲德菌素A(10微克/毫升)加入后1小
15、时,细胞的进一步4小时培养。细胞标记,然后与CD8 PerCP(用于煤制油)或CD56- PE的和CD3- PerCP和死亡细胞的鉴别(Miltenyi公司生物技术)的NK细胞培养,并在1PFA固定。分析是由门对CD8人口(CTL)的CD56的+已经或人口,不包括标有死细胞鉴别和FL3通道(NK细胞)外周血CD3细胞。对于细胞内干扰素- G的测定,细胞被视为以上,其中0.3皂素permeabilised并贴上干扰素的G - FITC标记(蓝光Pharmingen公司)前流式细胞仪分析。51Chromium细胞毒试验CTL的细胞毒性测定采用标准的4小时51Cr法21对梅尔- 888或无关的卵巢癌
16、SKOV- 3的目标。裂解百分比计算公式为:溶解= 100 (CPM的实验 -CPM的自发释放)/ CPM的最大释放-CPM的自发释放。结果呼肠病毒感染的黑色素瘤细胞分泌趋化因子IP - 10和IFN- 之前我们已经表明,呼肠病毒感染的人类黑色素瘤细胞株可能会诱导细胞死亡的免疫原性,伴随着中RANTES(CCL5的)、IL - 8、MIP- 1A型(CCL3)和MIP- 1(CCL4)的释放。此外,以病毒感染的黑色素瘤细胞脉冲作用于树突细胞,会分泌趋化因子CCl2,3,4,5,7,8,11(嗜酸细胞激活趋化因子)和CXCL10(IP - 10),而这些细胞培养的上清液会诱导NK细胞的趋化。我们
17、首次测试了黑色素瘤细胞株中趋化因子的大范围分泌,试图以评估其对直接病毒感染的应答。曾观察到通过直流脉冲reovirus-infected的Mel888细胞会分泌IFN-(但不是IFN-),我们也测试过reovirus-infected黑色素瘤细胞中1型IHN的产量。在此前的IFN- 的(但不是干扰素- )由直流呼肠病毒感染的Mel888观察细胞分泌的脉冲,我们还测试1型呼肠病毒感染的黑色素瘤细胞干扰素的生产。虽然有缺陷的抗病毒干扰素对肿瘤细胞的溶瘤病毒的反应可以解释肿瘤特异性溶瘤,这种反应可能不会完全废止。干扰素,特别是B可能在肿瘤微环境功能重要,因为它由reovirusinfected Me
18、l888负载直流分泌激活,增强NK细胞的细胞毒作用。除了趋化因子RANTES和MIP- 1A型和MIP-1和IL- 8,我们发现趋化因子和IP- 10(但不重态CCl2,第7和8 -数据未显示在所有四个细胞系)进行测试。的趋化因子水平相对较低(图1A),而IP - 10的是在所有细胞系(图1B)分泌较高水平。趋化因子是一种趋化因子CC家族的成员,可以有选择地聘请嗜酸性粒细胞,并已增加生存相关的一系列的癌症。的IP- 10是一种趋化因子,并为单核细胞,T淋巴细胞和NK细胞,这些细胞已被证实在体内引起免疫介导的抗肿瘤效应细胞趋化。1型干扰素是由正常细胞分泌的削弱病毒性感染,影响和调解多个先天和适应
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