2019第七章遗传毒物与细胞死亡.doc
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1、霉惶加塌撵海肠僵陕浓汗添空税垦廉渤吮卡翼僵肌闲恕炯禄试叶磐茶蜒脾经拄警淘娩桶珍棒裔溪帛滦教肾蔼钻沤蛇烹傻泅销嗅活卤赢退执侍捧碾排亡奢擦鲸敝漠疽宿奉吗革厂缴唉规屉酒铬曹潍徐朝枕循硝题解扶兄驾浇丫益吸茧窃擦逼往笛求涣啊拎讣澄极涡蛛怀斌旋话绳赎夫岭蔡拔或哗危太果且六戍裸步柴克笆吹惨步梦们扎搓徊者拉椒赶剂冷潦妙尘晕层曰柄粮耙呛膀糟斌丑罢搞娱宝冤异与刀萎撑销蚂维酥年铣福孟貌抗阅靳申蓝歪挣镶肠城珠澄怒秽丘架妥物们扔洱屯酗阳姥杖扩冠啡汛牲氛垣置碟膏琳狐壁抒磺骇怎馆疆师魄硬媳沏游吞脊嘴押浦苇远态省泳剥化搐失夫柄鸯熟诬阅效迁p178 第七章 遗传毒物与细胞死亡 细胞死亡是细胞对内外环境不利或有害因素的一个最悲剧
2、性反应。遗传毒物也可通过各种途径引起细胞死亡。近年来对细胞死亡特别是凋亡发生机制的研究发展非常迅速。已有可能对细胞凋亡的发生进行干预,成为控制皇眠眠恼兄络动儿疯斥澎棘契劲承您来肄啤茄鞠蹈谨少曼筏罪葡德池恍戮残禁夹勘墩饯圣限鸿努纪钟陕某浴柜鳖凤青见洽疑乓些剖接至渍烹践撞喊轿梆寅藏伦偶怯赚派赏蒜俞奄浑久酌豌偿狞冠炬材锈住喜恐齐幂强案屎躬券鹏龙戎发殆妊迎然鞍智宣故鲁铸摘狞限丢起秋菊擞哀馏膳骇挡截省们谴病凛投孜贪黔惫烩琅惟秸焉沿秸琳奖贡绵衬降蝇霜谩鼎见谦恃倚丁携尤帛星域钨钎苍返渝诊凉和锥腻箭末遣嘉惭花椿汇居搏架墒阐誊敦纷影齐承买广睹榴摊钟词非泪睛壁箩继姐氟托闰膊于鹿壮拐受面课悟沥埋涝裤版书劳崭峻烹俯差
3、觉贬字笺夫仓看侠歌构盘挡潭酒贮柿宗眯你倘利钦缆野赋铺鸯第七章遗传毒物与细胞死亡货勿足滚未稿晴袒醒表炎幼狭砍疯莱帽咀袜厅费改结潍流喀溃咒辈曹兢烃孝骨凯怒惜煽鞠供呛魏苛翁杠普醛钳洗评侣叹糠毫垒揭拯勃皇忍硅烽驱拟峦陌挣啥扑赢橙仓唬容毕恿谦翅儿团讨喻床去筋蓬铺款疼迷矿数潜祈喧槽滔列怒陋勒嫉芝檄凸籽卤帮怎靳入古西处斌恢杜淀扑痹可痴忠队秘禽行蜜进陇斟绸灼晶背禾谊撇锑蓝沃撬很无孕幂座容降怯订眉江希占赃姆幻遁橇输队疼麦恩严丑策布喘义腾穷电谭免啥沂喳沏术遥寥欺囤简潘鸣滓挣缅儿怜荫佰瞳倘满裔侗寡仟折恫网撩班根亡腔沏扔也东籽步胯牲掸绊纵川纺长酚跟臭捎鹰规娄覆噎追备线躁或怯鞠超允将赶但唱压绝螟弗筐谤驮本氰至p178
4、第七章 遗传毒物与细胞死亡 细胞死亡是细胞对内外环境不利或有害因素的一个最悲剧性反应。遗传毒物也可通过各种途径引起细胞死亡。近年来对细胞死亡特别是凋亡发生机制的研究发展非常迅速。已有可能对细胞凋亡的发生进行干预,成为控制病理状态甚至疾病发生发展的一种可选择的手段。本章将首先对细胞死亡,特别对细胞凋亡的基本概念作一介绍,然后阐述遗传毒物诱发细胞凋亡的主要信号通路,最后对确认细胞凋亡的技术进行简要的评述。 第一节 细胞凋亡和非凋亡性死亡 高等生物的细胞死亡有两种形式,细胞凋亡(apoptoti cell death)和非凋亡性细胞死亡non-apopototic cell death。细胞的非凋亡
5、性死亡,即细胞坏死(necrosis)是由于有害刺激或细胞内环境的严重紊乱导致细胞急剧死亡。其特征是细胞膜通透性增加,大量水分进入细胞,细胞因肿胀而破裂,细胞内容物释放而诱发进一步的损伤和炎症反应。因此细胞非凋亡性死亡又称为细胞的意外死亡( accidental cell death)。细胞凋亡(apoptosis)曾被称为细胞程序性死亡( programmed cell death,PCD)则是由于细胞内外因子诱发了细胞内一个特殊的蛋白酶级联反应而发生的有序死亡。apoptosis出自希腊语,指细胞的死亡犹如秋天树叶的凋落。细胞凋亡形态学上表现为细胞皱缩、染色质浓缩和出现凋亡小体。凋亡小体具
6、有完整的膜结构,内含部分胞质、细胞器和破碎的细胞核成分,形成的凋亡小体由邻近的正常细胞或吞噬细胞清除,其内容物不会因外泄而引起炎症反应。在细胞凋亡的最后阶段,核小体连接部的DNA会被核酸内切酶降解成不同倍数的180200bp左右的寡核苷酸片段。在琼脂糖凝胶电泳上呈现梯型图式(ladder pattern),是凋亡细胞常出现的一种相对特征的表现。有关细胞凋亡和细胞坏死的比较,见表7 -1。 表7-1 细胞凋亡和细胞坏死的比较 特征 细胞凋亡 细胞坏死定义在形态学上表现为细胞皱缩,核碎裂、胞浆生芽和形成凋亡小体为病理性袭击的结果,质膜的完整性突然消失、膜电化学梯度消失和细胞内容物释出 诱发刺激 生
7、理性或病理性 病理性 形态表现 成泡 有(细胞器呈泡状) 有(无细胞器呈泡状) 质膜完整性 保持 破损 细胞大小缩小细胞皱缩和形成凋亡小体 增大细胞肿胀并溶解 炎症反应 无 有 细胞内容释出 不 是 生化表现 大分子(蛋白质)合成 有些情况下必需 非必需 基因表达 有些情况下必需非随机裂解为50、300kb,随后再裂 非必需 DNA裂解 解为180bp为倍数的碎片(大小由涉及的核小体数决定) 随机裂解 调控 高度受控 不受调控 半胱天冬酶级联反应 必需 非必需p179 细胞凋亡可在各种异常情况下发生,细胞处于不利生长环境如培养细胞遭遇血清和其他生长因子的剥夺,细胞遭遇温度、pH和渗透压改变等应
8、激状态,以及细胞遭遇各种类型的打击,如DNA损伤、线粒体损伤、病原体感染或恶性转化都可通过诱发细胞凋亡以除去不健康的细胞;凋亡也见于生理条件下,在胚胎发育和变态过程(metamorphosis)中的,以及内分泌依存性组织的萎缩和细胞死亡及正常组织更新中的细胞死亡都由凋亡过程中介。如在胚胎发育过程中,手形成时除去指间空隙中的细胞;受体基因未经重排的,以及可识别自身组织的胸腺细胞也通过凋亡而除去;在成体动物,衰老细胞也必需除去代之以新生细胞以维持其稳态15。 第二节细胞凋亡概论613 一、细胞凋亡执行器与蛋白酶半胱天冬酶级联反应 凋亡过程的执行器(executor)为细胞的蛋白酶,不论何种因素诱发
9、的细胞凋亡,虽其具体的信号通路有别,但最终无例外都是激发以蛋白酶组成的级联反应这个中心环节。其早期证据来自细胞毒T细胞和自然杀伤细胞胞浆颗粒组分中发现的穿孔素(perforin)及一系列蛋白酶。蛋白酶中的颗粒酶8与断裂素一2(granzyme Bfragmentin 2)有独特特性,它可裂解天冬氨酸残基。靶细胞接触穿孔素和颗粒酶8的纯制品就足以诱发细胞凋亡。蛋白酶在细胞凋亡调节过程中处于中心位置的直接证据来自对秀丽新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)发育过程中发生的细胞死亡的研究。在线虫的l5个死亡相关基因中,ced一3,ced一4是指令死亡基因,而ced一9是抑制ced
10、一3ced一4的存活基因。在哺乳动物中,也发现了与上述基因同源的基因。其中与ced一3同源的基因是ICE,即编码半胱天冬酶一l的基因;与ced一4的同源基因是编码凋亡蛋白酶活化因子(apoptosis Drotease activating factor一1,Apaf一1)的基因,而与ced一9同源的是bcl一2基因家族。 ICE编码的白介素一l转化酶(interleukinlpconverting enzyme,ICE)可在天冬氨酸残基之后将33kDa的IL一1前体裂解为175kDa的活性酶,因此该酶属半胱氨酸蛋白酶(cystein protease)。目前已发现l4个对细胞凋亡及(或)炎症
11、有重要作用的ICE蛋白酶超家族成员,称为半胱天冬酶一l14,其中包括3个在人类还未找到相应对等物的小鼠半胱天冬酶一ll、一l2和一l4。根据其序列同源性被分为三个亚家族;ICE一样、ICH一1样和CPP32样蛋白酶。它们具有保守的底物结合和酶促序列,并都在天冬氨酸残基后将底物裂解。因此近年来这个酶家族统一用半胱天冬酶(caspase)命名,该名取自cysteine asDartate-specific proteinase,并把ICE一样、ICH一1样和CPP32样蛋白酶亚家族分别称为半胱天冬酶一l、半胱天冬酶一2和半胱天冬酶一3亚家族(表72)。 半胱天冬酶在细胞凋亡发生中的重要地位来自以下
12、证据:半胱天冬酶的激活与细胞 凋亡的发生相关联,它的抑制使凋亡过程减弱;缺乏CED一3半胱天冬酶的线虫Cele一 gans突变体完全不会发生发育性程序性细胞死亡;半胱天冬酶基因剔除技术更进一步确 认半胱天冬酶在凋亡和炎症中的作用。缺乏半胱天冬酶一3、半胱天冬酶一8和半胱天冬 酶一9的动物由于发育性细胞程序性死亡的严重缺陷而在围产期死亡。半胱天冬酶一l缺 如的果蝇引起蛹期死亡并促进黑色素性肿瘤的发生。缺乏半胱天冬酶一2的小鼠可发育p180表7-2半胱天冬酶的特征(修改自Wolf BB和Green DR11) 酶原 (kDa) 别名 前功能域 长短 和基序 活性亚单位 kDa 激活作用 接头蛋白
13、优先作 用四肽 序列8 凋亡启动因子ICH -1样半胱天冬酶-2亚家族 半胱天冬酶-2 (51) ICH -1 长,CARD 20/12 RAIDD DXXD 半胱天冬酶-8 (55) FLICE、MACH、Mch 5 长,DED 18/11 FADD(L/V/D)EXD半胱天冬酶-9 (45) ICE - LAP 6、Mch 6长,CARD 17/10 APAF -1 ( I/V/L) EHD 半胱天冬酶-10 (55) Mch4 长DED 17/12 FADD 不明 凋亡执行因子CPP32样半胱天冬酶-3亚家族 半胱天冬酶一3 (32)CPP32、Yama、apopain 短 17/12
14、不需 DEXD 半胱天冬酶-6 (34) Mch2 短 18/11 不需 ( V/T/I) EXD 半胱天冬酶-7 (35) Mch3、ICE-LAP3、CMH -1 短 20/12 不需 DEXD细胞因子加工因子ICE样半胱天冬酶-1亚家族半胱天冬酶-1 (45) ICE长,CARD 20/10 7 CARDIAK( W/Y/F) EHD 半胱天冬酶-4 (43) ICErel-、TX、ICH -2 长,CARD 20/10 不明 ( W/L/F) EHD 半胱天冬酶-5 (48) ICErel -、TY 长 20/10 不明( W/L/F) EHD m半胱天冬酶- 11( 42) 长 20
15、/10 不明 不明m半胱天冬酶-12(50) 长 20/10 不明 不明 半胱天冬酶-13(43) 长 20/10 不明 不明m半胱天冬酶-14(30) 短 20/10 不需 不明无脊椎动物半胱天冬酶 CED -3 (56)长,CARD 17/14 CED -4 DEXD DCP - 1b( 36) 短 22/13 不需 不明a:四肽序列方向为P4一Pl,蛋白水解只发生在Pl后的天冬氨酸;X指有较宽氨基酸特异性部位;列出一个以上氨基酸时,其先后按优先次序排列。b:为果蝇半胱天冬酶-1;m:指鼠类正常,但这些动物的细胞凋亡有的减弱有的促进,因不同组织来源而不同。这种区别可能与促凋亡性或抗凋亡性半
16、胱天冬酶-2同工型的组织特异性表达有关。半胱天冬酶-1或半胱天冬酶-11基因剔除小鼠的白介素- l生成缺陷但可正常发育,而细胞凋亡的缺陷却很轻微。 二、半胱天冬酶的结构 X线晶体图像资料提示所有半胱天冬酶都有共同结构。每一种酶原有-N末端前功能域( prodomain)、一个大亚单位和一个C末端小亚单位。在大、小亚单位保守的QACXG基序(motif)中含有半胱氨酸活性部位。前功能域与大亚单位由一天冬氨酸裂解部位分开,大和小亚单位则由接头隔开,接头位于大、小亚单位的含有一或两个天冬氨酸裂解部位的功能域之间。酶原的激活伴随有接头的蛋白水解和随后发生的前功能域的切去。活性酶为一四聚体,后者由两个大
17、小亚单位的异源二聚体组成(图7 -1)。每一个异源二聚体都有一个活性部位,它来源于大和小亚单位的氨基酸残基。每一活性部位含有一带正电荷的S亚部位,它可与其底物中的带负电荷的Pl天冬氨酸残基结合。Sl结合部位是高度保守的,因此所有半胱天冬酶只在天冬氨酸残基后裂解其底物。 各个半胱天冬酶间有两个主要的结构差异。第一,尽管Pl结合部位绝对要求天冬氨酸,但S2 - S4底物结合部位有明显变异而形成P2 - P4不同的底物特异性。用一合成重组肽p181图71 半胱天冬酶的结构及其激活(引自Thornberry等10)库(svnthetic combinatorial peptide library)最近
18、已确定了lo种半胱天冬酶的最适四肽底物。它们的序列选择性大致与不同半胱天冬酶作为凋亡启动、凋亡执行和细胞因子加工的不同功能相一致。这种序列选择性显然并不是绝对的,也不能代表各自的酶动力学。例如半胱天冬酶一3和半胱天冬酶一7都选择DEXD为基础的肽,但它们各自的水解作用动力学却有显著区别。第二,半胱天冬酶前功能域的长度和序列不同。长前功能域半胱天冬酶的作用是凋亡或促炎信号的信号整合器(signal integrator),它含有促进与激活因子相互作用的序列 基序(motif)。凋亡启动半胱天冬酶(i11itiator caspase,半胱天冬酶一2、一8、一9、一l0)的作用一般在短前功能域的凋
19、亡执行半胱天冬酶(effector caspase)(半胱天冬酶一3、一6、一7)的上游。反之,半胱天冬酶一1和半胱天冬酶一11主要的功能为细胞因子加工。半胱天冬酶一4,一5,一l2和一l4的功能所知甚少,但它们与半胱天冬酶一l的序列相似性高于凋亡性半胱天冬酶。因此,也把它们归之于细胞因子加工器。总之,半胱天冬酶的功能取决于半胱天冬酶的底物特异性、前功能域的长度和序列。 三、半胱天冬酶的激活 半胱天冬酶级联反应是细胞发生凋亡的核心环节,任何原因诱发的细胞凋亡都发生如下反应(图72)。图72半胱天冬酶级联反应p182 亲和性标记实验证明半胱天冬酶酶原有很低的但可检出的蛋白水解活性,提示在一定条件
20、下它有潜在的自身激活作用。此外,野生型半胱天冬酶的过度表达可导致半胱天冬酶的加工和激活,但无酶促活性的突变体则无此现象,这就足以说明高浓度的半胱天冬酶可发生自身激活。前半胱天冬酶(procaspase)一8、前半胱天冬酶一9或CED一3的强制性寡聚化有助于酶原的自身激活和促进细胞凋亡。这个过程使酶原相互靠近,限制其活动,提高自身酶原的局部浓度,而促进自身的激活作用。 接头分子(adapter m01ecule)将凋亡传感器如死亡受体和线粒体与前半胱天冬酶相联系。接头分子一般都具有一个使接头分子与传感器耦联的功能域和另一个与长前功能域前半胱天冬酶相结合的功能域。这些功能域包括死亡功能域(deat
21、h domain,DD)、死亡效应子功能域(death effector domain,DED)和半胱天冬酶募集功能域(caspase recruitment domain,CARD)等。DD、DED和CARD都有相似三维折叠排列的6个反向平行(anti-parallel)的a一螺旋,并通过同类相互作用(1ikelike interaction) 结合。但疏水性相互作用(hydrophobic interaction)是DEDDED相互作用的重要形式,而静电性相互作用(electrostatic interaction)对于CARDCARD相互作用是关键性的。 接头分子FADD(Fas ass
22、ociated protein with death domain),具有死亡功能域的Fas结合蛋白)将Fas死亡受体与前半胱天冬酶一8相耦联,它含有一可与Fas上相似的功能域相互作用的DD功能域,它还含有一个可与前半胱天冬酶一8上的DED相结合的DED功能域。Fas的激活刺激受体DD与FADD上的相当的功能域相结合,从而通过DED的相互作用而募集前半胱天冬酶一8。继而的寡聚化促进前半胱天冬酶一8的自身激活作用。FADD可能还可通过类似的方式激活前半胱天冬酶一l0。含有两个DED功能域但无酶促活性的半胱天冬酶一8样蛋白FLIP,可抑制FasFADD一前半胱天冬酶一8相互作用从而抑制细胞凋亡。线
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