2019聚谷氨酸发酵生产.doc
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2、: 学生 姓名: 指导 教师: 貉鞍榨苍姚表宪心寓墟捌涉盾猖君蹭凿巧误失遮彤锹稀矛蜂省向雍准专扼翱缨迸趣界信氏俄靴母欣谗珍葡勇柴琉岛裸蜘漠诀非纺幢蛮气赤蝴悼勋叠竖疹倔疆橙娃汁脱疟俱迎谎瓮淄栖呵澳狗旅胺芽旬啡汰管限蜕秤噬掺语翘毒首游舶董抑划剂悟壶掩手汇皮辑峻团罪维圭擒泌蒲貉翠担妻仍嫂徊寓尧误氧渡擒妊酱处伴娄肇袄哩问贯学颜挝厌寺距迪捆既磷骋婉澈笆羚典孵性孰淋咕唱烁卵彰狭综冉烬滦缕锅篙梅蓑垦组捐淋娥邢抹蛛驮恍糕鉴讹伯鹰蔚薛追静硷毅雄它影稚曾詹梳袱裳私瞳操仕充烙顾氏俞共睁匪叼恨澜部抨翟肘譬际掣澳讼虐行咸脐醇侄舰彪施疤吉疟弹有轩凌堕捶迷脓该拎屠渭考聚谷氨酸发酵生产趋径飞绍哭千植汛仓屿极气葫蜀蚂孔从疽盔轻
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4、称: 2013-2014 春季学期生物工程专业课程设计结题论文不同分子量聚谷氨酸制备条件研究学院(系): 年级 专业: 学 号: 学生 姓名: 指导 教师: 教师 职称: 摘 要. -PGA 是一种有极大开发价值和前景的多功能性生物制品,近年来被作为增稠剂,保湿剂,药物载体等而一直被广泛应用于工业领域。它是一种水溶性和可生物降解的新型生物高分子材料,可通过微生物合成。在生产低聚谷氨酸工艺当中,利用微生物发酵法生产聚谷氨酸具有很好的前景,但在利用微生物发酵法制备产物时,生产的聚谷氨酸具有较大的分子量,需要对其进行进一步的降解处理。本设计拟对微生物发酵生产的高分子量的聚谷氨酸进行降解,并优化其降解
5、条件,从而得到不同分子量的低聚谷氨酸分子,并利用琼脂糖凝胶电泳和高效液相凝胶色谱检测其降解后的分子量,从而确定最佳降解条件。本设计主要分为三个部分对不同分子量的 -PGA 的制备情况进行了研究。第一部分是通过微生物发酵,提取得到 80-100 万分子量的大分子聚谷氨酸产物的设计;第二部分根据聚谷氨酸分子特性,设计筛选可降解大分子聚谷氨酸的方法,并优化降解条件,得到不同分子量的低聚谷氨酸分子,并找到合适的方法进行分离纯化;第三部分是在前两部分的基础上,通过建立琼脂糖凝胶电泳和液相凝胶色谱检测不同分子量低聚谷氨酸的方法,从而设计出最佳的制备条件。关键词:生物发酵法、聚谷氨酸、降解条件、检测方法 目
6、录第一部分 文献综述31.1 -聚谷氨酸简介31.2 聚谷氨酸结构31.3 -聚谷氨酸性质:41.3.1 吸水特性41.3.2 生物可降解性51.3.3 -PGA 的水解特性52. -PGA 的应用前景52.1 -PGA 的应用52.1.1 聚 -PGA 是一种微生物絮凝剂62.1.2 -PGA作为一种新型的高分子吸水性材料62.1.3 -PGA作为新型的药物载体63. -PGA 合成方法73.1 化学法合成73.1.1 传统的肽合成法73.1.2 二聚体缩聚法73.2 提取法合成83.3 微生物生物合成法83.3.1 代谢途径84. 研究进展85. 总结本设计的前景分析以及研究意义95.1
7、前景分析95.2 研究意义10第二部分 课程设计部分111.材料121.1 实验原料和试剂121.2实验器材122. 方法132.1 微生物培养方法132.1.1 平板培养132.1.2 种子培养132.1.3 摇瓶发酵132.2 -PGA的纯化方法132.2.1 菌体的分离132.2.2 乙醇沉淀132.2.3 丙酮分级沉淀132.2.4 透析袋透析除盐132.2.5 硅胶薄层层析142.3 生理指标的测定方法142.3.1 生物量测定142.3.2 细胞数测定142.3.3 分子量分析142.3.4 粘度的测定152.3.5 pH 稳定性的测定152.4 碳源试验152.5 氮源试验152
8、.6 前体物质 L-谷氨酸试验162.7 碳源、氨源、前体物质正交试验162.8 无机离子正交试验163. 实验设计163 .1培养基营养成分对聚谷氨酸分子量影响的设计163.1.1 培养基中不同碳源对聚谷氨酸分子量影响的设计163.1.2 培养基中不同氮源对聚谷氨酸分子量影响的设计173.1.3 培养基中前体谷氨酸对聚谷氨酸分子量影响的设计173.2 培养基中碳源、氨源、前体物质正交试验的设计173.3 不同 pH 对不同分子量聚谷氨酸影响的设计分析174. 设计分析174.1 培养基营养成分对聚谷氨酸分子量影响的设计174.1.1 碳源对产物-PGA分子量合成的影响的设计分析174.1.2
9、 培养基中不同氮源对聚谷氨酸分子量影响的设计分析184.1.3 培养基中前体谷氨酸对聚谷氨酸分子量影响的设计184.2 培养基中碳源、氨源、前体物质正交试验的设计184.3 不同 pH 对不同分子量聚谷氨酸影响的设计分析185 总结体会19参考文献21第一部分 文献综述1. 概况背景1.1 -聚谷氨酸简介-聚谷氨酸(-PGA)是一种由微生物生物合成的聚谷氨酸,它由 D-谷氨酸单体或L-谷氨酸单体以羧基和氨基相缩合而成1。在生物体内 -PGA 生物相容性良好,可以降解为谷氨酸而直接被生物体吸收,对于用作生物医用材料有明显优点。另外,主链上有大量游离羧基存在,使 -PGA 具有水溶性聚羧酸的性质,
10、如强吸水和保湿性能,可用于化妆品、食品、分散剂、螯合剂、建筑涂料、防尘等领域2-3。这些活性位点为材料的功能化提供了条件。由于其良好的环境友好性,在注重环保强调可持续发展的今天,这种来自生物的可降解型功能材料受到人们的青睐。1.2 聚谷氨酸结构对 -PGA 的氨基酸组分分析表明,该物质只有谷氮酸一种氨基酸组成,其纯化样品在 216 nm 处有吸收峰,与典型蛋白质吸收峰不同。-PGA 经硅胶层析后,用不同官能团显色剂处理,萘酚、间苯二酚、甲基苯二酚反应呈阴性,双缩脲反应阴性而茚三酮反应阳性,该物质没有典型的肽链结构,也不是一种环状多肽。随着温度的提高,-PGA 水溶液在一定的温度范围内粘度变化不
11、大,聚合物结构较稳定。在高温下,粘度下降快-PGA 水解也很快,分子量逐渐变小,-PGA 的水解是由链的随机切割引起的。不同生产方式得到的-PGA 的分子量有差异,如采用地衣芽孢杆菌摇瓶发酵得到的 -PGA 的分子量为1.06 105 Da,而通过 5 L 发酵罐生产的 -PGA 的分子量为 2.47 105 Da。-PGA 的等电点为 3.47,它是一种酸性氮基酸聚合物。1.3 -聚谷氨酸性质:1.3.1 吸水特性由于 -PGA 极易溶于水,因此其具有很好的吸水特性,王传海等对-PGA的吸水性能进行了研究,结果表明,-PGA 的最大自然吸水倍数可达到 1108 倍,比目前市售的聚丙烯酸盐类吸
12、水树脂高 1 倍以上,对土壤水分的吸收倍数为 30-80 倍。-PGA 的水浸液在土壤中具有一定的保水力和较理想的释放效果,有明显的抗旱促苗效应。在0.206 mol / L浓度的 PEG(6000)模拟渗透胁迫条件下,-PGA 仍有较强的吸水和保水能力,可明显提高小麦和黑麦草的发芽率,用其直接拌种也能显著提高种子的发芽率5。-PGA 的吸水性和保水性可使 -PGA 被广泛应用于干旱地区保水以及沙漠绿化。1.3.2 生物可降解性生物可降解性是-PGA 的特性之一。所有-PGA 产生菌株都可以以 -PGA 作为营养源进行生长。在培养液中存在一种与 -PGA 降解有关的解聚酶。其它自然菌株也具有降
13、解 -PGA 的能力。以 -PGA 作为唯一碳源和氮源对可降解 -PGA 的菌株进行筛选,结果筛选出至少 12 株可降解 -PGA 的菌株6。由此可知,发酵生产 -PGA 的培养时间对产量有较大的影响,时间过长会导致 -PGA 分子被酶解而损失。1.3.3 -PGA 的水解特性-PGA 的水溶液在 10 mL、浓度为 6 mol / L的 HCl 中,抽真空封口,105 的烘箱的条件下可以水解为谷氨酸,吕莹等7的研究表明,水解 17 h、25 h、48 h的结果一致。此特性可用于 -PGA 纯度的测定。2. -PGA 的应用前景2.1 -PGA 的应用-PGA是一种天然存在的水溶性的聚合氨基酸
14、,具有生物可降解性,可食用且对人体和环境无毒害。近年来其被作为生物絮凝剂,增稠剂,加湿剂,药物载体,药物缓释剂,生物可降解纤维,高吸水性树脂,重金属吸收剂以及食品添加剂等一直被广泛应用于工业领域如食品工业,药物工业,化妆品工业及污水处理中,是一种有极大开发价值和前景的多功能新型生物制品。2.1.1 聚 -PGA 是一种微生物絮凝剂-PGA可以用作饮用水、废水、发酵食品工业下游过程溶液的生物絮凝剂以及重金属或放射性物质螯合剂,用于回收金属盒减少环境污染等。2.1.2 -PGA作为一种新型的高分子吸水性材料近年来,人们把水溶性高分子作为精细化工的骨干产品之一,越来越受到人们的重视。它的应用范围几乎
15、涉及人所能涉及的任何领域。随着高分子材料的快速发展,在其重要性日益突现的同时,人们发现了它的不足之处,即大部分的人工合成的高分子材料在自然界难以降解。在人们越来越关心自己生存环境的今天,不可降解的高分子材料造成的“白色污染” (如聚乙烯、聚丙烯等),也越来越受到人们的关注。为了解决这个问题,人们开展了各种研究工作。制成了各种可生物降解材料8。在日本,聚谷氨酸得到广泛应用,主要以谷氨酸 -甲基酯为基础,生产新型聚合物IITC。此类聚合物可以用来制造皮革、纤维、食品包装膜等。聚合 D-谷氨酸用苯乙烯改性后,可得到高抗碱性的纤维树脂。若通过改性再聚合,可得到比一般天然纤维和化学纤维更优的材料,如外科
16、手术的缝合线,就是以氨基酸和羧酸为基础,由易水解纤维状和薄膜状的聚合物制得的。而渗透杀菌剂、防腐剂、抗生素的聚合氢基酸对伤口和皮肤病还有防治作用。以谷氨酸和烷基谷氨酸酯的共聚物为基础,研制出来的聚合物是药品很好的包裹材料,可作胶囊或糖衣片。日本九州大学原敏夫等人通过大豆发酵,提取 -PGA,用电子柬照射,制成 -PGA 树脂,这种物质呈白色粉末状,具有极强的吸水性,其吸水性能是纸和尿不湿的 5 倍。-PGA 吸水饱和后,呈凝胶状,可包裹在植物种子的表面上作为种子的理想包衣材料。原敏夫认为,这种树脂是沙漠绿化的好武器,并提出了中国绿化沙漠的设想(原敏夫 特开平)。另外,-PGA 作为一种凝胶材料
17、,也可以起分子筛作用9。2.1.3 -PGA作为新型的药物载体-PGA 具有良好的生物亲和性和生物降解性,作为药物载体可提供药物缓释性、靶向性,提高药物水溶性,降低药物不良反应,从而提高药物疗效。(1)用作金属螫合物抗癌药物顺二氯二氨铂(CDDP)的载体该药物为重金属络合物,微溶于水,且在水中不稳定,疗效低,对细胞毒性大,用 -PGA (相对分子量 4 104)作为药物载体,可形成有活性的、相对稳定的 CDDP-PGA 复合物,该复台物有较高的动力学稳定性和对正常细胞较低的毒性,有利于 Pt2+ 对配体的亲和,而且其治疗剂量范围宽。(2)作为水不溶性植物类化疗药物的载体化疗药物大多难溶或不溶于
18、水,细胞毒性大,选择性小。如喜树碱难溶于水,而且它的内酯形式不稳定,导致使用受限制,疗效低。但10-羟 CPT 或9-氨基 CPT 与 PGA 偶联形成 CPT-PGA 复合物后,水溶性大为增加。复合物对同源的和异源的肿瘤都保持较高的抗肿瘤活性。(3)用作抗生素类抗癌药物阿霉素的载体,可明显地提高疗效。(4)-PGA 的半乳糖或甘露糖酯化衍生物可作为肝细胞特殊药物的载体,通过糖酯化的 PGA 的结合作用把相对分子量低的药物运送到肝细胞中,起到了靶向作用。(5)-PGA与明胶有较好的兼容性,适合制作外科及手术用的可生物降解的粘胶剂、止血剂及密封剂10。3. -PGA 合成方法3.1 化学法合成3
19、.1.1 传统的肽合成法传统的肽合成法是将氨基酸逐个连接形成多肽,这个过程一般包括基团保护、反应物活化、偶联和脱保护。化学合成法是肽类合成的重要方法,但合成路线长、副产物多、收率低,尤其是含 20 个氨基酸以上的纯多肽合成11。3.1.2 二聚体缩聚法由L Glu、D-Glu 及消旋体(D,L Glu)反应生成 -甲基谷氨酸,后者凝聚成谷氨酸二聚体后,再与浓缩剂 1,3-二甲氨丙基-3-乙基碳亚二胺盐酸盐及 1-羟苯基三吡咯水合物在 N,N-二甲基甲酰胺中发生凝聚,获得产率为 44 % 91 %、相对分子质量为 5000 20000 的聚谷氨酸甲基酯,经碱性水解变成 -PGA。化学合成法难度很
20、大,没有工业应用价值。3.2 提取法合成早期,日本生产 -PGA大多采用提取法,用乙醇将纳豆(一种日本的传统食品)中的 -PGA 分离提取出来。由于纳豆中所含的 -PGA 浓度甚微,且有波动,因此提取工艺十分复杂,生产成本甚高,同样难以大规模生产。3.3 微生物生物合成法迄今为止的发酵生产仍处于试验室阶段,小试生产方法归纳起来主要有分批发酵法、连续发酵法、液体两相发酵法、搅拌罐反应器自循环发酵法、固体发酵法和固定化酶法等 6 种,分批发酵法简单方便,容易操作和控制,因此在实验室研究中用的较为广泛。3.3.1 代谢途径自从1942 年 Bovarnick 等发现芽孢杆菌属微生物能在培养基中蓄积
21、-PGA以来,利用微生物生物聚合生成 -PGA 的研究十分活跃。人们对不同的微生物进行了代谢途径分析,由于分析手段和其他人为原因的限制,以致现在 -PGA 的代谢途径仍然是一个黑箱模型。4. 研究进展由于 -PGA 具有环境友好等特性使其应用日益广泛,对其研究越来越多,然而目前国内主要是对 -PGA 生产方面尤其是菌种及发酵条件的研究,而且大多数发酵生产仍处于试验室阶段,实现其产业化还有一定距离。国外对其应用研究则比较多,尤其是在附加值比较高的医药领域。在今后研究中,一方面是在提高 -PGA 产量同时建立一种生产成本低廉、生产工艺简单、生产条件温和的工艺,为大规模生产奠定基础:另一方面是不断扩
22、大应用研究的广度和深度,同时进行创新性研究12。5. 总结本设计的前景分析以及研究意义5.1 前景分析近年国内强大的需求释放与巨大的产能缺口,是化工新材料被广泛看好的最重要的理由。新材料技术是 21 世纪三大关键技术之一,是发展信息、航天、能源、生物等高新技术的重要物质基础已成为全球经济增长的源动力和各国提升核心竞争力的焦点。包括新的功能聚合物、复合材料、高性能化的通用塑料新品种、可降解塑料、纳米材料等。与传统化工材料相比。它们具有优异性能或特殊功能对国民经济特别是高技术领域及尖端技术有重要作用。长期以来,新材料产品及其原料对外依存度较高,一些高端品种甚至完全依赖进口。而近年来国内龙头企业通过
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