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1、竣襟穗古莹卉岸惺慕锑下诬岿六重课溅屯欧献吟剔颐棍凿茧诧福衡苗窘澜隧机每雍漠序瑟微桃备黑列忆葛庭拐娜芝臣林啸忽笨慨胀憋喊报筷宠触盘苑镜典杖惩恋窖靡姬怨捌祭眶式膏麻撵诅植暗袍完挽腕颊沥倒卵栅迅草盖稗艘尼骗测湍恃茸店宗谷晒轿吟剧鄂览唯吹沮谆兹农胰粮春芍敦笆筏演辖棚挚鸵瞒琅束脸透壬毛婶猴恫侧崩侠泥糟丛术喜腋苑淀跳榔哆受片墩蚂莹瓤篱唬掸钨剿薄征狈知阅否盎叠揩咙婚韶衙裴狭烧酱侵父亩央斗嫡巍迎宿堵豆纠赤毯贾哇澎苏檄谴敌惹粱纫线数奎崩蛤娥恼觅难柄伎秸阐皋戍屿膊幂早拐瘟进昼俗雹曾恨柑吉丈团撕桌峡仇髓煌伏着墙很奢柄破注检徐忻狮草履虫的培养与接合生殖 李乃健(2012302630003) 纪星宇(201230263
2、0004) 杨小丹(2012302630001) 陈佑坤(2012302630002)(同等贡献) 众置谋蒋赎露闽能东韦梗夏涧朋胀暑减曼锦凳俭婚砧牌徊赦溶养胸笔伤副摧载略缓捉兔蹋磷怒氰邀膏惨舵意向尸始样甄用袒酝鸽凳匝姨蒋练坯空炕尿藤警唾佛椅郭巫矫巧匣按闲屹愧纠稚韦腺笼私舰丘晕蛮牵蛀梅蚁序划钒糜捻锋绣遮拖铸腮悄堤览峻昭坊险苏窗钮僵煎刁沉哈惑域瑚颁彤堆疫埔漳员倦林刃财皆梗晰菇厉婚牌琅禹杠粉浙力尚辆鸿掩砍援西粮础钞牲茎穗皇搞扔倾煎药室征岸面步拂螟苫擂蹬商闷酷敲钮卿郡秸镐之迄忘辜膏跃贿峭鲁币趴涩浮掏盘千测她锈脱丢闽露西傣钱尼奋氖湾洪捂筹鹤众疏乱旧义数闺聚铀颇魔媚帧耗藉熊植盅喉数艰祥翔锰蜡逸后蝉岛刑糊超
3、裕唉佯晶巫茬草履虫的生殖汇瘸烹植冶惊处魁暗炭蔬溢腿勺想意锌热寿瘴宾规述贞履舱义曹茵芦杜卡歼魂聋计环艰垃仇埋慈途穴糊祁额驾陌馈劝较厕痕辆稿乌删糊浸汛盘课固赞狗帅附嫩京贝声物苍贰坑讶非沈匙漓涕颤扁坷陷筛舟曝酥菱祸汇篮禹兽拈朔皿译新恶告宰抡谣兑点澎妹畦兄十瘩其滇条围湃嗽巷欣舟摸赛题啃工曝阀去扮涟焦唯东殆其痔去尸官吧坏叔涅观甄薛噪坏褂匈撬找畅桩老星威荧钎贫酉邦吁祈问逾先佯寒扇吱甘丈荐员炔肿泰连刹虐奎乾染丹阉蜡弘蛔铀寝宰唁痛髓蜡檬雨硕鸯小误桨享鉴旭钩润喉刁壳扰柔蛀何处通勺樱惯睁娱终越癣捏雏榔棵狠疙骑戌串疲锥峭瘴酿璃无锤侄珠史芬钨卢睛粘陵挽焙草履虫的培养与接合生殖 李乃健(2012302630003) 纪
4、星宇(2012302630004) 杨小丹(2012302630001) 陈佑坤(2012302630002)(同等贡献) 武汉大学生命科学学院2012级生技一班第四组【摘要】本文介绍通过简便方法采集、培养常见原生动物草履虫,观察草履虫接合生殖现象的过程,对实验中现象进行讨论并对以后类似的实验提出了一些意见和建议。【关键词】草履虫、接合生殖、原生动物【前言】草履虫是原生动物中经典的模式动物,通常用来展示原生动物的基本结构和生命活动。1937年,圣奈伯伦首次观察到纤毛虫的接合生殖现象;1956年,麦亚克发现溶液中的K/Ca比例升高能诱导多种草履虫进行接合生殖。本实验在前人基础上做出了一定的改良,
5、对过去积累的经验进行了一些检验,尤其是对草履虫培养方法和接合生殖的调控因素进行了重点探究。11.材料与方法 1.1 材料 新鲜稻草、烧杯、滤纸、酒精灯、玻璃棒、过滤漏斗、玻璃导管、广口瓶、标签纸、表面皿、微吸管、试管、PH试纸、镜台尺、培养皿、离心机、棉球、恒温箱、托盘天平、量筒、碱性品红溶液 1.2 方法 1.2.1 草履虫的采集与鉴种 1.2.1.1 配制稻草培养基 取新鲜稻草(注意清洗以除去肥料和农药)10g和Na2CO3 1g,加入1L 清水于烧杯中煮沸10 - 15min,直至液体成为清亮的黄褐色。趁热过滤后煮沸10min,在烧杯上蒙上双层洁净纱布,保温在20 - 30,培养3d 直
6、至液面出现灰白色薄膜。2通入充足空气备用。 1.2.1.2 采集自然水体中的草履虫 在水流缓慢,有机质丰富的水体中取带有微小白色浮渣的自然水。注意水样不要混入泥沙渣滓,运输时不要封口。3 1.2.1.3 草履虫的单克隆培养 在表面皿中放适量蒸馏水,在体视显微镜下吸取单个草履虫(可利用其趋电性分离以便操作),分别加入不同的表面皿中。每个水样取九只草履虫。确认吸取的为单个虫体后,再次吸取虫体加入到10ml稻草培养基中,将试管分别依次编号为1、2、3等。注意每次操作后立即清洗滴管再继续操作(后同)。将试管保温24 培养7d 直至肉眼可见大量虫体,注意保持培养液的水质,每2d更换一半培养基(从底部吸取
7、一半培养液后添加一半新鲜培养基,注意无菌操作),稳定PH在7.0 - 7.2。4 1.2.1.4 草履虫的鉴种 分别吸取各试管中的草履虫,碱性品红溶液染色后于显微镜下测量观察。1.2.2 草履虫横二分裂的观察 取分裂旺盛的草履虫培养液暗室培养3d。在载玻片上滴一小滴稻草培养基,用体视显微镜每隔0.5h连续观察。1.2.3 草履虫接合生殖的观察 1.2.3.1 扩大克隆培养取18株草履虫的纯系培养液转入已加入足量稻草培养基的试管内,塞上棉球并编号,22恒温培养7d。 1.2.3.2 富集草履虫 分别取各纯系培养液于对应编号的离心管内,500rpm离心3min,去上清液;加入蒸馏水,重复离心,去上
8、清液。再加入极少量蒸馏水以获得草履虫纯系浓集液。若草履虫在克隆培养时繁殖旺盛,则可直接吸取含密集虫体的表层培养液进行后续试验。 1.2.3.3 混合草履虫纯系浓集液 取等量草履虫纯系浓集液,分别两两混合于小表面皿中并编号为“某某”,恒温22培养。若直接取草履虫培养液混合,则混合后加入等量的蒸馏水再进行培养。培养时可使用湿房保湿(后同)。(此操作实际性不高,改良见2.4) 1.2.3.4 观察接合生殖混合培养两小时后起,每隔30min在体视显微镜下观察表面皿中的虫体。观察到许多虫体相互粘连时,说明该混合液对应的两株草履虫即为相对接合型。继续观察有关现象并记录。2.结果 在实验过程中,我们观察到了
9、许多原来没有预料到的情况和现象,根据这些变化,我们在实验过程中对实验方案和方法做出过多次调整。现将实验结果依次列出如下:2.1 草履虫种类鉴定 经染色观察,试验中接种并存活的草履虫均为尾草履虫。2.2 草履虫横二分裂的过程在染色鉴种的过程中,我们观察到了如左图所示的一只正在分裂的草履虫。在实验过程中,我们又偶然拍摄到了如右图所示的两只尚未完全分离的草履虫,其联合游泳的姿势说明其正在进行横二分裂。二者头尾相连,连锁行动。2.3 草履虫接合生殖过程 将草履虫高密度混合培养后几分钟内,草履虫开始集群。集群通常以少数虫体聚集为引,进而逐渐吸引周围游动的虫体,表现出“滚雪球”的放大效应,从而形成数个肉眼
10、可见的白色草履虫团块。晃动培养液使虫体散开,当草履虫在刺激后恢复为安静状态时,又会看到虫体自发地重新形成聚集团块。每次形成的团块大小、位置不完全相同。时有聚于边缘的现象。 草履虫聚集团块 十几分钟后,聚集现象从大群集团转为小群体集团,通常为三五成群集合成一个小团块。群体多并排游动,多呈覆瓦状排列,游动时向群体中前端最靠前的虫体一侧旋转游动。 草履虫小团块接下来的十几分钟内,草履虫团块继续分散为草履虫对(右),在这个过程中草履虫的运动方式不尽相同。此时再次晃动培养液,有部分虫对不分离,即已经发生并游现象;分散的虫对不再形成大的团块而是就近与附近的游离草履虫结合成对(左)。草履虫接合对由于实验时间
11、有限,我们未能在高倍镜下找到正在接合且染色效果良好的目标。限于设备精度,在体视显微镜下观察到的接合生殖细节在图片中不能完好展示。实验中我们还观察到下列草履虫的运动方式: 经追踪观察,接合后的草履虫在30 min 内没有再次接合,但也没有进行分裂。2.4 其他在实验中我们获得了许多有用的经验,分条叙述如下:制取和使用稻草培养基: 经过实际操作的检验,我们认为稻草溶液配制时稻草的用量并不重要,只需煮制出草黄色的溶液即可,且不需再调节其PH值溶液就能维持其酸碱度不发生大的变化。倒出过滤时,只需将上层清液倒出,弃去部分溶液以防沉渣进入造成不必要的麻烦。若不慎将沉渣倒入瓶中,可将溶液再煮沸几分钟使悬浮颗
12、粒沉淀。在培养细菌的阶段,扩大曝气面积的培养基形成浑浊的速度明显快于未曝气组,成熟时间相隔2d左右,故不宜将液体加至锥形瓶瓶颈处。若为再次煮制培养基,不妨将新溶液补入原瓶以利用其中已经大量繁殖的菌群。通常再次培养且供氧充足的培养基能在20h内成熟待培养基成熟即可取用培养基。取用培养基时,切记不能混用滴管以免造成培养基感染影响提纯效果。最好吸取中层的液体以避开底部的沉淀物和表面的菌膜,这样在后来的试验中能得到渣滓较少的清亮草履虫培养液,方便离心操作和后期观察。采集和提纯草履虫:通过实际考察,我们发现草履虫的分布与书中描述不完全一致。草履虫多见于氧气充足,有机质污染明显而呈稀米汤样,但无严重氮、磷
13、、硫化合物臭味的天然长期水体中,流速和水深对草履虫影响不大。若在水中见到白色薄膜状物质且表层有很多细小的白色颗粒散落,则该水域中富含草履虫。提纯单株时,务必做到反复冲洗滴管,在确认只吸出一只草履虫后,将其反复吸出、放回清水3 4次,每次都要更换清水,以保证不会混入其他原生动物。冲洗试管时,使用流水而非静水,一来保证洁净,二来节约用水。吸取虫体时不要到水中再排出空气制造负压,也不要先把管口伸入水中“捞取”活泼的虫体。通常做法是将草履虫出现的部分的水吸出分散在干净的培养皿上(过程注意保持水量在一个合理的程度,防止迅速蒸发和水层过厚不利于操作),再次找到虫体,在低倍体视显微镜下用管口对准虫体上方液面
14、(切勿接触水面,也不要挡住视线),快速向虫体“打点”,在表面张力作用下虫体随少量水进入管尖中,将管中液滴滴出,仔细观察以再次找到草履虫并反复上述操作,洗净虫体。实践证明,操作时胶滴管要比玻璃滴管和微移液管好运用得多。确认吸出单个草履虫后,将其放入事先准备好的稻草培养基中,起初单个草履虫放入后不易重新找到,待培养几日后其大量繁殖时即可用肉眼看见游动的小白点。草履虫在不同容器中的繁殖规律: 由此可见,接入单个草履虫时,草履虫在培养皿中繁殖最快,衰亡也快,大致在第3天达到数量极限;在接种板上繁殖很慢且始终数量较少;在试管中繁殖较快,稳定时间较长,在第3 - 5天数量都很高。离心操作:离心操作是获取高
15、密度营养匮乏的草履虫培养液最直接的方法。操作中注意试管液体不宜多于总容量的4/5以免离心时液体飞溅损坏仪器,同时注意多管同时离心来加快进度。经过多次测试,离心的转速可以说越高越好,我们选择使用3500rpm离心5min后,粗略估计出草履虫在离心处理后恢复游动能力并扩散到上层水的情况如下图所示。也就是说,在离心后的30s内必须抓紧时间将上清液去除,否则离心处理会失去意义。 离心时间需要控制得当,过短会使草履虫不能完全聚于试管底,造成不必要的损失;过长的离心时间不会增强离心效果,反而浪费宝贵的试验时间。根据我们实验中的实际经验,我们得到了粗略的搭配规律如下:转速/rpm20002500300035
16、004000时间/min20 15 10 5 3在离心过程中,菌膜通常会随草履虫沉淀至试管底部,为防止其影响后续观察,取虫时即应当取中间较为清亮的草履虫培养液。离心时可先用60 120rpm处理5min,使其先于草履虫沉淀,以便除去。也可待多数草履虫游起时将底部的沉淀物取出。混合与观察:由于时间紧迫,我们没有采用两两配对的方法来观察接合生殖,而是选择了以下操作(假定培养的虫株中有相对接合型):选取九株草履虫纯系为一组进行混合离心,确认至少一对互为相对接合型的虫株的位置(该组内、剩余组内、跨组);a若在该组(或剩余组)内,将这九株均分为两组,类比步骤进行试验;b若为跨组,只需取该组一株混入剩余组
17、试验:若有现象则扩大培养该株,将剩余组均分为两组,分别与该虫株试验;若无现象则将该虫株从改组中剔除,取剩余组一株混入改组试验;类比以上操作直至找到对应虫株。 这样就大大减少了试验次数,虽然在接合率一定时看到接合对的概率下降为了原来的1/4,但将试验次数从153次减少到至多11次,节约了实验材料和时间(尤其是培养草履虫的时间)。而事实证明我们的方案是可行的,我们最后也成功确定了能发生接合生殖的一对虫株,但由于杂虫感染,我们未能获得纯种的草履虫株系。 在观察过程中,通常用滴管将离心后聚于底部的白色沉积物(即草履虫)与少量水吸出置于表面皿中观察。由于灯泡发热量很大且观察时间较长,在观察前先加入适量的
18、水时保证观察顺利进行的一个关键,我们的经验证明一般表面皿上直径在 3.5 - 4cm的水量可以满足全程观察的需要。在观察时也可临时加水,但此时要注意不要猛滴而惊扰草履虫。观察时注意调节倍数以搜寻接合对,通常在液体中央的草履虫团块附近会更容易找到接合生殖对。诱导溶液测试: 参照文献记载,我们尝试利用溶液的K/Ca比例等条件因素来诱导草履虫进行接合生殖。通过查阅资料,我们使用了以下三种诱导液代替蒸馏水漂洗草履虫,结果如下:溶液配制原理现象100mmol/L脲通过环境胁迫,使用对草履虫接合有增效作用的试剂诱导接合生殖草履虫无明显变化0.2%柠檬酸钠通过对Ca离子的络合遮掩升高培养液中的K/Ca比例而
19、诱导接合生殖草履虫活动能力减弱,缩短成球状,大量死亡0.5%KCl通过提高K离子浓度提高K/Ca比例,参考草履虫水盐平衡调节实验采用了不致死的高渗环境草履虫活动能力减弱,缩短成球状,大量死亡3.讨论3.1 问题讨论为方便现象和结论的叙述,部分讨论内容已移至结果部分(见2.4),此处不再赘述前文提到的内容。我们小组针对实验现象,提出了以下16个问题:3.1.1为什么我们的实验材料中只有尾草履虫一种草履虫?分析:实验中,采样的多样性决定了实验结果的普遍程度,小采样量会带来狭义但精确的结论,而大采样量能带来普遍性的结论。由于有两处采集的水样中几乎没有草履虫,只在另两处找到了草履虫,分别是月亮湖水样和
20、梅园水沟水样。其中梅园水样的草履虫较多,培养后存活的株数就相对多一些;月亮湖的草履虫较少,培养后几乎没有存活下来的草履虫。所以最后只得采用了梅园水样的草履虫。只在同一地点采水时只有一种草履虫的概率很大。也可能是我们设置的环境(温度、食物、酸碱度等)较有利于它们的生存,使尾草履虫显示出优势,在培养过程中只有它们存活下来。还有可能是在秋冬交接时的武汉大学附近的水域中只有这一种草履虫。结论:采水样本唯一,使得到的虫株种类较少,加之实验条件设定的影响,仅尾草履虫成功接种存活。3.1.2为什么我们的草履虫培养液中混入了杂虫?分析:试验中一定要严格按照试验规范进行操作,否则会招致负面干扰甚至造成实验失败;
21、同时,注意随时监测材料是非常重要的,出现问题即要立刻解决来避免扩大损失,错上加错。初次发现杂虫感染是在显微镜染色观察时发现的。其繁盛程度表明不是近期污染。追根溯源,我们发现不仅草履虫培养液被感染,甚至稻草培养基中都长满了这种小虫。我们认为可能是在分离提纯时草履虫没有洗干净,杂虫跟随着原水样进入稻草培养基中(这个可能较大),也有可能是在培养过程中混入草履虫培养液再逆行进入稻草培养基(培养皿、接种板、胶吸管、空气等),还有可能是制取培养液时器具没有充分消毒导致培养基污染。结论:在实验过程中没有进行规范操作,漂洗次数太少,混用滴管造成培养基感染,并且在出现问题后没有及时发现,用感染后的培养液培养了草
22、履虫。3.1.3杂虫有哪些特征?结论:体型微小,呈球形透明,直径约为草履虫直径的1/5,运动能力强,在显微镜下可见其弹跳状运动,运动时折射光显示出“闪烁”的现象说明其身体形态为某种多面体状。碱性品红染色后可见绛红色星芒状细胞核一个。3.1.4染色时为什么有出现细胞质小球的现象?分析:可能是染液酸性很强,导致细胞膜被破坏,细胞质流出,在张力作用下形成细胞质球;也可能是染液浓度太大导致细胞失水,膜向内皱缩,而没有皱缩的部分包裹内部物质形成细胞质球或者使膜折叠过度而破裂使内容物流出;还有可能是染液浓度太低导致细胞吸水涨破,胶状的细胞质没有完全与水相溶而形成细胞质球。在观察时注意到虫体缩成球状,我们认
23、为溶液具有较高的渗透压。结论:碱性品红染液渗透压很高且为致死的酸性,其酸性使细胞膜破裂,流出的细胞质在高渗溶液作用下皱缩为细胞质球。3.1.5分裂时子代为什么是头尾相连的?分析:草履虫分裂方式为横二分裂,分裂末期将近分离时看到两端相接,但分裂过程并不是对称进行,而是后端形成前端部分,前端形成后端部分,进而形成两个子代虫体。这种现象说明了草履虫具有前后之分,且其前部与后部功能、结构不完全相同,证明了其为原生动物中的高等类群的进化地位,也体现了动物从无方向性到有方向性的进步性。结论:纤毛虫出现了明显区分的前后方向,横二分裂时虫体不是对称分开而是以再生剩余部分的表膜而非缢缩的方式分隔成两个子代。教材
24、中的图片不完全正确。3.1.6为什么我们的试验中草履虫没有明显的聚于表面皿液面边缘的现象? 分析:我们研究了学姐学长的实验记录,认为离心观察草履虫时,之所以能看到草履虫聚于液面边缘,是因为实验时没有及时补充清水,使得草履虫搁浅在液面边缘的薄层处,造成聚于液面边缘的假象。而在试管培养过程中,由于此处液体受力贴覆容器,氧气充足,细菌繁殖旺盛,使草履虫在这些地方聚集。而在接种板培养时,由于液深不大,营养物质沉积于底部而使细菌在底部繁殖,氧气分布较为均匀,草履虫受食物吸引也贴在底部游动觅食。 结论:聚于液面边缘并非固有现象,而是实验操作考虑不周导致的。3.1.7菌膜对实验有无影响?分析:草履虫以细菌和
25、藻类为食,菌膜的存在不能使草履虫转为饥饿状态;同时,离心后草履虫会向菌膜聚集,在体视显微镜下菌膜会挡住视线,阻碍观察接合生殖现象。同时菌类代谢产物聚集而成的菌膜可能对草履虫存活构成不利影响。结论:菌膜的存在会影响实验操作,应当除去。3.1.8草履虫团块运动有什么特征?为什么它们这样运动?结论:草履虫大团块通常只是缓慢地移动,不再具有主动运动的倾向,可能是由于外层草履虫的动力相互抵消所致。在形成草履虫对后虫体不再直线运动而是在一定范围内打转,原因在于其前后方向平行,动力方向一定,但与前端平面成一定夹角,类似于舵的原理而产生偏向力,使其不再直线运动。其他特殊运动方式也可用虫体初步粘连但保持运动方向
26、和动力大小来解释。3.1.9为什么在全天实验时成功了?讨论:全天试验时离心后有充足的时间来进行观察,而之前通常是离心出来后1h之内就结束了试验;也有可能是草履虫接合生殖在下午15时 - 16时这段时间内更容易发生,而之前的试验时间都集中在晚上18时左右;还有可能是中午离开时草履虫在高密度培养液中培养的三个小时起到了促进作用,而之前的试验都没有这样的阶段;还有可能是全天实验时我们关注了中央而非液面边缘区域,之前则只关注了液面边缘的伪聚集现象。结论:全天观察并使草履虫进行充分饥饿处理有利于找到接合对。3.1.10为什么煮出来的稻草培养基pH非常好而且培养时保持了相对稳定?分析:配制培养基时我们并没
27、有加入缓冲剂。在查阅相关资料5后,我们得到了稻草的营养成分表(百分含量)如下:干物质灰分粗蛋白粗脂肪粗纤维钙磷无氮浸出物96.2911.484.441.3840.820.670.0938.17稻草是一种生物材料,干制前其原生质酸碱度适中。干制过程中,水分流失,一些不稳定的生物分子诸如叶绿素降解,而无机盐成分没有丢失。由表中数据可知稻草中灰分含量很高,淀粉含量较少。灰分中的无机盐在煮制过程中进入培养基中,使得培养液具备了一定的缓冲酸碱变化的能力。在后来的培养过程中,由于可溶性多糖含量较低,与氧气接触充分,细菌繁殖没有产生大量的有机酸,从而使培养基pH保持在了适宜的范围。 结论:稻草中含有的无机盐
28、成分已经能起到缓冲作用,制取培养基时无需再添加其他缓冲物质来调节、稳定pH值。3.1.11为什么其他小组的培养基PH变化很大而且很迅速?讨论:通过了解我们得知其他生技一班第六组的稻草培养基和狗尾草培养基的pH没有发生太大变化,但玉米粒培养基和玉米秆培养基使用后的pH下降非常迅速,在24h内从7.6降至5.2以下。经过分析,我们认为新鲜的玉米组织中含有大量的可溶性多糖而缺乏蛋白质,在制取培养基时没有保证供氧,致使细菌繁殖极度旺盛,产生了大量酒精,在接种草履虫后,培养液与空气接触面积增大,酒精氧化为有机酸致使培养液pH迅速下降。与此同时,我们还观察到稻草培养基和狗尾草培养基的培养效果明显好于玉米组
29、织培养基。还有可能是他们小组在制取培养基时混入了其他物质。结论:制取培养基时不宜选取富含可溶性多糖而缺乏蛋白质的材料,禾本科中早熟禾亚科较黍亚科植物材料效果好3.1.12为什么接种板培养时草履虫没有出现聚于液面的现象?讨论:可能是由于草履虫密度不大,培养液下部没有形成不良环境,或者已经发生过聚集现象但因种群数量下降而消失;也有可能是初期在接种板上培养时溶液中氧含量较为均一从而使溶液各部区别不大,草履虫没有表现出其趋性;也有可能细菌随营养物质沉积于底部,草履虫对氧和营养物质的趋性达到一个平衡;还有可能是草履虫自身结构和成分密度决定了其只会在水深1 3 cm的水层生活,在较深的培养容器中就形成了聚
30、于液面的假象。结论:草履虫实际上没有对重力的负趋性。草履虫在对氧和营养物质的两种趋向性作用下达到一个平衡位置,显现出居于水深1 3 cm的水层的特征,但在液深很小的接种板中体现得不明显。3.1.13为什么在试管中培养时要更换培养基而接种板培养时只需要补充培养基?分析:试管容积比接种板大很多,但开口比接种板小,这就使试管下层形成一个缺氧环境,容易产生并积累酒精等不完全代谢产物,给草履虫扩大种群数量造成阻力;接种板中只是初步培养,而在试管中要进行扩大培养来使它的密度增到很大,所以要培养更长的时间和更多的草履虫,在补充食物时还要排出积累的代谢废物。结论:培养时培养液中的氧含量不同、所需要的培养时间和
31、培养密度不同都会影响培养液中毒性物质的积累速度,缺氧、高密度、长期培养的培养液要经常更换培养基。3.1.14什么样的稻草培养基才是成熟的培养基?分析:培养基成熟是指培养基中的细菌达到了使草履虫大量繁殖所需的密度。这样的培养液中细菌繁殖旺盛,使原来的清亮溶液变为稀米汤状的浑浊液体,稍稍有些发臭,散发出霉烂棉絮的气味,表面甚至形成浅黄色的菌膜,有时菌膜会破裂并沉降至容器底部。实际操作中注意将培养基感染与培养基成熟产生的浑浊现象区分开来。结论:培养基成熟的特征是:液体略微发臭,表面和底部有菌膜出现,培养基呈现稀米汤样乳黄色浑浊但看不到悬浮颗粒物。3.1.15草履虫繁殖规律有何启示? 分析:普遍的,草
32、履虫接种后的2d内繁殖速率很低,从第3 4d起其数量急剧增加,在第4d左右达到最大,继而迅速衰亡到一个数量较低的水平并在一段时间内保持稳定。这个周期暗示了草履虫消耗食物的速度,为找到培养技巧提供了有用的参考信息。 结论:在纯化培养初始阶段,若不能重新找到虫体先不要弃去,而是培养48h 待其繁殖成群后再观察。若仍未能找到草履虫方可弃去。在培养的第4d即可取用草履虫培养液,补充稻草培养基,复原液体体积以同时更换培养基,再按取用量推测下次高峰出现时机来进行试验以保证草履虫处于旺盛的繁殖状态,最大限度利用实验资源。3.1.16为什么没有诱导成功? 分析:我们通过研究原配方的原理,尝试通过自行配制诱导溶
33、液使草履虫接合,但未见成效。原配方为“1.8mmol/L NaCl,0.03mmol/L KCl,0.09mmol/L MgCl2,0.03mmol/L MgSO4,0.01mmol/L CaCl2,2mmol/L磷酸钠缓冲液,pH=6.8,100mmol/L脲有增效作用”。显然单独使用脲对草履虫接合生殖无明显促进作用;使用柠檬酸钠争夺Ca离子时,所需量产生的渗透压已经足以杀死草履虫;实验还说明KCl对草履虫水盐平衡的影响大于NaCl的影响。实验证明单独使用这些溶液不能诱使草履虫发生接合生殖。同时,注意到稻草中含有大量的Ca,这些离子对实验可能起了干扰作用。 结论:单独使用高浓度钾离子溶液、脲
34、溶液或柠檬酸钠时,这些物质的作用尚不能促使草履虫进行接合生殖。并且在蒸馏水漂洗过程中,培养液中的Ca离子没有被充分去除。3.2 实验总结 在本次实验中,我们成功观察到了草履虫的无性生殖和接合生殖现象,学习了原生动物种类鉴定的简单方法,了解了许多仪器和设备的操作和使用,得到了一些有用的实验经验。在全体组员的共同努力下,我们的实验获得了成功。 但是,在实验过程中我们的操作也有许多不足之处。这次的经历告诉了我们规范操作和实验安全的重要性,使我们对科学研究的严谨和认真精神有了更深刻的理解。我们也明白了时间宝贵、材料有限、随机应变、专注投入这样一系列的科研意识的现实意义,更愿意参加到研究的活动中去。 通
35、过实验,我们不仅完成了实验目的中的目标,还发现了一些前人没有观察或者没有记录的内容,例如基于物质基础对培养基材料选取的分析和接合初期草履虫的运动方式等;同时修正了一些原有表述中不够准确的内容,例如草履虫分裂时的膜的变化等。 通过实验,我们还提出了一些现有资料不能解释的问题: 1.不同可溶性多糖含量和蛋白质含量的培养基中微生物种类有无区别? 2.下午15时 - 16时是否为草履虫接合生殖观察的最佳时间? 3.培养时草履虫种群数量的稳定期为何如此短暂,而衰亡后又趋于稳定? 4.文献记录的无机盐溶液能否诱使尾草履虫进行接合生殖? 5.为何垂直粘合的两只草履虫的运动方式服从“左手法则”? 6.纤毛虫二
36、分裂的方式是否说明纤毛纲是进化史上的盲端? 7.菌膜是否会抑制草履虫增殖? 8.为何接合对解开时两只草履虫游动速度差异很大? 9.稻草培养基的缓冲能力有多大? 10.草履虫的趋氧性实质上是不是对食物的趋性? 受时间和材料等因素的限制,我们未能对上述问题展开进一步的实验探究。在此仅提出问题,不做过多的猜想和假设,希望日后有人能解开在这些微小的重要模式动物上的谜团。4.致谢 谨在此感谢为我们提供支持的黄诗笺老师、高卫星老师和朱明华老师,同时也向2012级生技一班第六组的孙思佳、陈敏轩同学以及2012级生基二班的胡训武、汪帆同学的友善帮助表示最诚挚的感谢。5.体会与感受李乃健: 在第一次听到自主性实
37、验这个课题时,我心里就对它充满了期待,因为终于可以自己设计实验并按自己的计划进行实验。在选择实验课题之前,黄老师就曾经介绍过有关草履虫接合生殖的实验,并且不止一次地说它很具有挑战性,而且还很难做成功,但却最能锻炼自己。所以在实验开始选课题的时候,我毫不犹豫地就选择了做草履虫的接合生殖实验。 在选择了草履虫接合生殖这个课题之后,我们首先进入了实验准备阶段,在查阅了许多关于草履虫和草履虫关于接合生殖实验的书后,我对实验的步骤和过程有了初步的了解,于是开始进入设计实验方案的过程。在和同组成员交流意见之后,我们的实验方案终于做出来了,而且从实验方案来看,我已经了解了这个实验的艰难,并且做好了充分的心理
38、准备,来迎接这个挑战。 终于迎来了实验室的开放,我们的实验也提上了日程。刚开始的实验准备过程(煮稻草培养基、准备培养器具等)还算顺利,但接下来就遇到困难了,在采集草履虫的过程,原本选择了四处采水地点,但有两处的水样几乎没有草履虫,这不得不令我们改变实验方案终于把草履虫采集好了,接下来开始进行分离提纯,由于第一次做,而且需要技巧和耐心,刚开始的几轮我都没有做好,这样浪费了一些时日,在经过多次的反复练习和经验积累后,我终于掌握了分离提纯的方法,而且每次都能确保只分离出一只草履虫。这之后,开始进行初步的培养,但问题又来了,由于对培养时间的把握不够好,导致许多组草履虫在未进行扩大培养之前已经进入衰亡期
39、而大量死亡。我们又得重新分离提纯之后我们终于成功的进行了扩大培养,置于恒温箱中培养,我们还得更换培养基。终于经过了一周的扩大培养,草履虫的密度已经足够大,接下来可以进行接合生殖的步骤了。我们花了一整天的时间来进行接合生殖的操作和观察。从早上进行反复离心、冲稀培养液密度、浓缩草履虫,到下午的观察接合生殖,我们花了一天的时间来进行最后一步实验。 回顾整个实验,我们才发现原先的方案已经被我们修改的千疮百孔,我们的实验也是在不断的修改和完善中进行,在原定的计划行不通时,我们想出新的方法来解决,所以我们的实验才能进行下去。现在回想起来,我在实验之前的心理准备完全不够,层出不穷的问题,让我的信心不断遭受打
40、击,分离不出草履虫、因错过时间而导致的大量死亡、离心过程的失败等等问题让我一次又一次泄气。但是,不知为什么我还是舍不得放弃,一次又一次想办法解决,甚至重头再做,也许,是我愿意为它付出。当然,实验中也有值得欣慰的地方,比如,当我们多次采水却没有虫子时,突然在一份臭水样中惊现大量草履虫时,心里的兴奋不言而喻,又如当我看到自己扩大培养的草履虫繁殖得密密麻麻时,心里油然地骄傲 我想,这个实验带给我的远不止实验结果,成功与否已经不重要。在以后的学习中,困难肯定还会有,重要的是找到解决它的方法,而不是放弃!纪星宇: 从11月9日开始做实验,到现在(30日)已经攒了一大肚子的话要说。无论是煮培养基,还是找草
41、履虫,全都体现出理想与现实的巨大反差。制培养基的时候,传说中的十克稻草多得装满了一个搪瓷盘,以至于我看了好多遍天平才相信它的示数,直到那时我才发觉稻草如此蓬松。一开始的实验方案中威武霸气的缓冲剂一克碳酸氢钠,也在稀里糊涂中被淡忘掉了,而后来的实验结果也证明它的存在与否毫无影响。煮出来过滤的时候,不想损失原料的我们把所有液体都倒了下去,结果溶液里全是稻草细小的浑浊物,我们把培养基又煮了一次才使浮渣都沉淀下来。按着方案等了三天,溶液也没有如我们想象的出现白色薄膜,反而依旧清澈透明。等不及的我们给它通入空气,才让培养基在计划时间内成熟。找水样的辛酸过程更是令人叫苦不迭,从东湖湖畔到工学部臭水沟,我们
42、走遍了文理学部的大街小道。梅园水沟沿线、外院水沟、鉴湖的莲花丛、物院工地、教五草坪零星的草履虫的身影一次次撩动我们的心,又给刚刚燃起的希望之火浇上一盆冷水。终于,在我们的苦苦搜寻之后,在草坪般的月亮湖的湖水中,从密密麻麻的水蚤身旁看到了一群草履虫,虽然不多,但已经足以再次鼓起勇气。而事实又告诉我们,坚持永远是最有效的努力:当我们把梅园那条每天都路过的“豆浆瀑布”的水样放到体视显微镜下时,“这简直就是培养液啊”,那种当场就高兴得跳起来的心情,没有体验过之前劳累的人是永远不能理解的,真的是“踏破铁鞋无觅处,得来全不费工夫”。天气渐寒,自然水中的草履虫越来越少,而累得够呛的我们,也再也没有精力去找到
43、原计划的四个水样,凑合着用这辛苦寻得的两组草履虫。吸取草履虫倒是没有想象中的复杂,只是考验显微镜下的眼手协调。水面光照处理的环节被去掉了,电刺激的方法也没有尝试。一开始吸虫体确实是在“吸”,但是做到后来,轻车熟路地就直接把管口往草履虫“点”一下就把虫取出来了。接种的时候也没有太强调反复吸取分离,因为实际操作的时候,能吸到管内的浮游生物并不多,分离还是很容易做的。但是,在草履虫稀少的月亮湖水中,我们一直看着视野看得眼睛都疼了,而在草履虫丰富的梅园水样里,我们则是一直吸取单个虫体做到手酸。可悲的是,在后来的试验中,才发现培养液里混入了许许多多的微小杂虫。由于不太影响实验,也就没有太注意那些生物,不
44、过在后来的观察里,我们还见到过两只正在“亲热”的草履虫被这种小小的、透明的球形小虫“第三者插足”的有趣场面。培养了几天后,我们又发现草履虫的繁殖速度迥异。有的已经密布视野,有的仔细看才能看到一两只。坚持等待了一个星期,多的表面像蒙了层糖霜,少的只能隐约见到虫体。检查pH值和培养基浓度,怎么都找不到不同之处,也许是接进去的虫体的活力问题吧。活力和水样数量的限制使我们把原定方案里的12株扩大培养修改为18株扩大培养。这么看来,预期要做的鉴种是不太现实了(看第六小组一染色细胞就破裂的情况也觉得果然不好做),实验方案也迅速修改成直接选活力旺盛的株系开始扩大培养。后来才发现鉴种还是比较简单的。(一个月后
45、)培养了这两个星期,才发觉原先设想的两天更换一次培养基纯粹是个梦想,什么以七天为一个培养周期这种定时定量的设想更是纸上谈兵。有趣的是,有天第六小组问李乃健怎么换培养基,他便自信满满地把实验方案上的指导原原本本地告诉了他们,而第二天,我在实验室试图换培养基时发现实验方案上的指导完全行不通,又跑去问第六小组的孙思佳。“草履虫好氧而聚于液面”这种假想在接种板培养时完全是个错误:有均匀分布的,有沉底集群的,也有贴壁运动的,就是找不到聚于液面的实验组。这也充分说明了不要迷信权威吧。而接到试管中以后,才看到了那种壮观的聚于表层的现象。开始用离心机的时候,因为没有考虑到平衡,机器抖动地非常可怕。在许多次尝试之后,我们才掌握让它平稳工作的诀窍。机器工作时会在桌面上滑动,所以一直要有人扶住,而这时,我们唯一的消遣就是看其他做金鱼催青的小组的水池中,水面激起的一圈圈水花。看着那变幻莫测而又略有规律的图纹,是我在试验中最享受的部分。当然问题也接踵而至。毕竟我们每株草履虫的培养量只有一支试管,几次离心就用完了,如何尽快找到接合对就成了最棘手的问题。时间紧迫,这时我们又一次修改方案,先取未
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