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1、UPLC H-Class系统及硬件维护 2014 Waters Corporation 1 ACQUITY UPLC HACQUITY UPLC H- -Class Class 系统系统 2014 Waters Corporation 2 ACQUITY UPLC HACQUITY UPLC H- -Class Class 系统系统 ? 核心系统 ? 四元溶剂管理器 (QSM) ? 样品管理器 Flow Through Needle (SM-FTN) ? 柱温箱 (CH-A) 支持所有现在的 ACQUITY 检测器 2014 Waters Corporation 3 ? 支持所有现在的 ACQ
2、UITY 检测器 PDA and PDAe TUV FLR ELSD QDa ACQUITY UPLC HACQUITY UPLC H- -ClassClass 四元溶剂管理器四元溶剂管理器 ? 操作特点 最大流速 = 2mL/min 最大操作压力 = 15,000 psi ? 四元溶剂混合 2014 Waters Corporation 4 四元溶剂混合 ? 自动混合功能 ACQUITY UPLC HACQUITY UPLC H- -ClassClass硬件简介硬件简介 ? 四元溶剂管理器四元溶剂管理器四元溶剂管理器四元溶剂管理器-Quaternary Solvent Management
3、System (QSM) 脱气机 泵 GPV (比例阀_Gradient Proportioning Valve) 2014 Waters Corporation 5 GPV (比例阀_Gradient Proportioning Valve) Inlet manifold Solvent handling unit ACQUITY UPLC HACQUITY UPLC H- -Class Class 溶剂脱气机溶剂脱气机 2014 Waters Corporation 6 QSM Degasser / GPV QSM Degasser / GPV 流路流路 3- GPV Outlet to
4、LP Mixing Manifold inlet Sample Manager Purge Solvent Degasser Chamber 2014 Waters Corporation 7 2- Degasser Chamber outlet to GPV inlet 1- Solvent Bottle to Degasser Chamber inlet QSM QSM 流路流路 Primary Head Accumulator Head Vent Valve 100 l Mixer 2014 Waters Corporation 8 Gradient Proportioning Valv
5、e Pairs Low Pressure Mixing Manifold Degasser Chambers Seal Wash Pump QSM QSM 泵头流路泵头流路 Primary Head Transducer to Accumulator Check Valve Accumulator Head Transducer to Vent Valve 2014 Waters Corporation 9 Low pressure Inlet Manifold to Primary I2V GPV Outlet to Low Pressure Inlet Manifold I2V Actua
6、tor Inlet ManifoldInlet Manifold Knurled Knob SS Fitting 2014 Waters Corporation 10 Support Bracket Pump Pump 流路流路 2014 Waters Corporation 11 过滤器过滤器/ /混合器集成装置位置混合器集成装置位置 2014 Waters Corporation 12 废液管理器废液管理器 来自于检测器的 废液 2014 Waters Corporation 13 来自于进样器的 废液 来自于密封清洗 的废液 QSM QSM 控制面板菜单控制面板菜单 2014 Water
7、s Corporation 14 WaterAcetonitrile 自动混合(自动混合(AutoBlendAutoBlend TechnologyTechnology) 2014 Waters Corporation 15 AlcoholConcentrated Modifier WaterAcetonitrileWaterAcetonitrile 95%0%45%50% 自动混合梯度自动混合梯度 2014 Waters Corporation 16 Water 1%TFAIsopropanol AcetonitrileWater 1%TFAIsopropanol Acetonitrile
8、0%5%0%5% 100%Water 0%Acetonitrile 0.05%TFA 50%Water 50%Acetonitrile 0.05%TFA 肽图谱方法开发肽图谱方法开发 TFA TFA 浓度变化浓度变化 - - %D%D AU 0.00 0.05 0.10 0.15 AU 0.20 0.25 0.05% TFA 5% D 0.025% TFA 2.5% D 2014 Waters Corporation 17 AU 0.10 0.15 AU 0.05 0.10 0.15 0.20 Minutes 27.0027.5028.0028.5029.0029.5030.0030.5031
9、.0031.5032.0032.5033.0033.5034.0034.5035.0035.5036.0036.5037.00 0.1% TFA 10% D AutoBlendAutoBlendTM TM Plus TechnologyPlus Technology 2014 Waters Corporation 18 AU 0.00 0.05 0.10 AU 0.00 0.06 0.12 AU 0.10 pH 6.1 pH 7.0 pH 6.9 A A A+B B B C C C 2014 Waters Corporation 19 AU 0.00 0.05 AU 0.00 0.05 0.1
10、0 AU 0.00 0.05 0.10 Minutes 0.005.0010.0015.00 pH 7.6 pH 7.1 A mixture of proteins was separated using cation exchange chromatography- alpha- Chymotrypsinogen A (peak A), Ribonuclease A (peak B), and Cytochrome C (peak C) A A B B C C AutoAuto Blend PlusBlend Plus Solvent library with pH & other solv
11、ent characteristics 2014 Waters Corporation 20 User now programs Gradient profile in pH & Salt strength Two independent Waters Curves characteristics ACQUITY UPLC HACQUITY UPLC H- -ClassClass 样品管理器样品管理器 - -FTNFTN ? 可变进样体积 标配进样体积可达 10uL 最大扩展至 250uL 进样 ? 进样针在流路中的设计 全体积样品进样 更低的交叉污染 2014 Waters Corporat
12、ion 21 更低的交叉污染 ? 覆盖全范围的进样盘和样品瓶 ? 支持预加载样品和定量环离线功能 ACQUITY UPLC HACQUITY UPLC H- -ClassClass 样品管理器样品管理器 - -FTNFTN Wash Solvent Purge Solvent 2014 Waters Corporation 22 样品管理器样品管理器 FTNFTN 样品加载样品加载 2014 Waters Corporation 23 样品管理器样品管理器 FTNFTN 样品进样样品进样 2014 Waters Corporation 24 样品管理器(样品管理器(FTNFTN)正面流路一览)
13、正面流路一览 至定量注射阀的管 路连接 单向阀单元 进样阀管路连接 2014 Waters Corporation 25 清洗溶剂入口管路 (没有脱气) 漏液传感器连接 处 样品注射器 内部流路内部流路 针驱动装置 SS Needle Needle Lug Latch 2014 Waters Corporation 26 针密封清洗集 成装置 R-Carriage End Plate 针密封清洗装置针密封清洗装置 针进样的位置针进样的位置 2014 Waters Corporation 27 进样针的类型进样针的类型 ? 标配的不锈钢针, 15 L 作为标配安装在样品管理器中 ? 不锈钢针包,
14、 30 L 2014 Waters Corporation 28 最耐用的针 选配的扩展环选配的扩展环 ? 50 L 扩展环 ? 100 L 扩展环 ? 250 L 扩展环 2014 Waters Corporation 29 样品管理器样品管理器 FTN (flow through needle)FTN (flow through needle) 2014 Waters Corporation 30 样品管理器样品管理器 FTN (flow through needle)FTN (flow through needle) 2014 Waters Corporation 31 ACQUITY
15、UPLC HACQUITY UPLC H- -ClassClass色谱柱温控制色谱柱温控制 ?温度范围: 室温 +5 到 90C ?2.1 到 4.6 mm, 最长可达 150 mm 色谱柱接在线过滤器或预柱 ?标配主动预热装置 2014 Waters Corporation 32 ACQUITY UPLC HACQUITY UPLC H- -ClassClass主动预热主动预热 ? 确保温度控制的一致性 ? 消除环境对色谱柱温度带来的影响 ? 减小系统体积以减少额外的色谱柱谱带展宽 ? 兼容之前的被动预加热装置 2014 Waters Corporation 33 主动预加热器主动预加热器
16、2014 Waters Corporation 34 ACQUITY UPLC光电二极管矩阵(PDA) 和可调紫外可见(TUV)检测器 2014 Waters Corporation 35 和可调紫外可见(TUV)检测器 ACQUITY UPLCACQUITY UPLC PDAPDA和和TUVTUV检测器检测器 ? 提高的灵敏度 ? 优异的噪音抑制性能 ? 光引导流通池设计 两种流通池选件能够满足更广泛的应用范围 2014 Waters Corporation 36 ? 低电子噪音 高亮度灯 ? 宽动态线性范围 ? 支持最大80 Hz的采集速率 独立的数据采集速率和滤波常数 ? 全控制台软件控
17、制 为何使用为何使用UPLCUPLC 专用检测器 专用检测器? ? ? 更快的洗脱峰需要更高的数据采集速率 降低样品谱带在流通池中的停留时间 ? 更小的峰需要最大的信噪比S/N 高光通量/传输 更快的数字滤波时间常数 2014 Waters Corporation 37 ? UPLC分离需要低扩散体积的流通池 保持峰形 不产生高反压 ACQUITY UPLCACQUITY UPLC PDA PDA 检测器检测器 ? Waters ACQUITY UPLCPDA检测器 最大采集速率80 Hz 最小化的噪音 o10 AU 最大化的光谱分辨率 最大化的线性范围 2014 Waters Corpora
18、tion 38 最大化的线性范围 o为杂质和痕量分析提供更宽的动态范围 o用更短的分析时间获得更好的数据 o高可信度的数据结果 流通池 o新颖的光引流通池设计 o更长的激发光路能够给出更好的吸光度和灵敏度 ACQUITY UPLCACQUITY UPLC TUV TUV 检测器检测器 ? Waters ACQUITY UPLCTUV 检测器 80 Hz 最大采集速率 最小化的噪音 o6 AU 最大化的线性范围 2.5 AU 2014 Waters Corporation 39 o2.5 AU o为杂质和痕量分析提供更宽的动态范围 o用更短的分析时间获得更好的数据 o高可信度的数据结果 流通池
19、o新颖的光导流通池设计 o更长的激发光路能够给出更好的吸光度和灵敏度 ACQUITY UPLCACQUITY UPLC 高亮度灯高亮度灯 ? 高亮度氘灯 低噪音特性 能够输出近两倍于普通氘灯的亮度 (能量) ? 好处 低噪音 更高的灵敏度 2014 Waters Corporation 40 更高的灵敏度 ? 灯的保证寿命 2000 小时 ? 前面板拆装 ? 软件对灯的固件控制 运行时间 点灯 序列号 反压调节器反压调节器 ? 反压调整器能确保溶解在流动相中的气体不会产生气泡,从而保证基线平稳 不受气泡噪音的干扰 ? 如果UV检测器是系统中的最后一个检测器,一定要装配反压调整器 ? 如果在PD
20、A/TUV后面还连接有质谱或其它检测器则无需装配反压调整器 2014 Waters Corporation 41 ? 如果在PDA/TUV后面还连接有质谱或其它检测器,则无需装配反压调整器 ACQUITY UPLCACQUITY UPLC 检测器检测器 - -快速数据采集速率快速数据采集速率 UPLC 条件 色谱系统: ACQUITY UPLC (BSM, SM, TUV) 色谱柱: 2.1 X 50 mm BEH C18, 1.7 m 流动相:50% of A: 10 mMol Ammonium Bicarbonate pH=10 50% of B: Acetonitrile 流速: 1.2
21、 mL/min 进样体积: 1 L (5 uL Loop, 30 uL PEEK Needle, PLUNO, 1 uL air gaps) 强洗 = 75% ACN/25% Water (250 uL) 弱洗 = 50% ACN/25%Water (1000 uL) 样品室温度: 15 C 柱温箱温度: 45 C 检测器: ACQUITY TUV 301 nm, Various data rates, FTC=Off 样品 = 0.05 mg/mL Benzocaine, Butamben, and Tetracaine in 1:1 Buffer/ACN 数据: Empower 2 1 P
22、oint per Second 2 Points per Second AU 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 2014 Waters Corporation 42 ? 对于UPLC, 检测器的采集速率必须足够大,以确保完整检测到狭窄的 UPLC峰 ? ACQUITY UPLC 检测器支持从1到80Hz的各种采集速率,以满足任何 UPLC应用的需要 ? 有效的积分算法和独立的时间常数,确保了精确的和可重现的积分 Second 5 Points per Second 10 Points per Second 20 Points per Second 40 Po
23、ints per Second 80 Points per Second0.00 0.05 0.10 0.15 Minutes 0.120.140.160.180.200.220.240.260.280.300.320.340.360.380.400.420.440.460.48 ACQUITY UPLCACQUITY UPLC 独立的采集速率和滤波常数独立的采集速率和滤波常数 2014 Waters Corporation 43 ? 采集频率和滤波常数的单独优化,使得在确保分辨率和灵敏度最优的 条件下,找到最佳的检测参数 PDA PDA 通用通用( (General)General)界面界面
24、 2014 Waters Corporation 44 2D 2D 通道通道 ? 吸光度 ? 基线补偿 (MBF) ? 最大吸收值绘图(Maxplot) ? 波长差减 ? 波长叠加 比率(Ratio)波长 2014 Waters Corporation 45 ? 比率(Ratio)波长 2014 Waters Corporation 46 开机顺序及注意事项 开机前的准备工作开机前的准备工作 ? 有机溶剂要求用色谱纯(进口名牌最好) ? 水或缓冲盐流动相要用超纯水(18.2M),当天制备 ? H-Class对洗针液的要求 针内部由流动相清洗,在运行过程中针是系统的一部分 2014 Waters
25、 Corporation 47 针外部由Wash Solvent在每次进样前软件控制清洗 ? 清洗柱塞密封垫(Seal Wash)的溶液 超纯水含5%-10%甲醇或乙腈 ? 特别提示: 以上溶剂或溶液均需: 用0.22m的膜过滤并脱气 用洁净的玻璃容器盛放,避免污染 ACQUITY HACQUITY H- -Class Class 开机操作开机操作 ? 打开计算机电源,进入Windows操作系统 ? 打开ACQUITY H-Class QSM和SM-FTN电源 ? 先不要开TUV或PDA 电源 2014 Waters Corporation 48 ? 光学检测器的电源需待流动池内充满液体后再打
26、开 ? 待各仪器设备通过自检后(绿灯长亮),打开Empower软件 ? 输入用户名及密码后进入Empower主画面 进入样品采集画面进入样品采集画面 2014 Waters Corporation 49 进进进进入控制台入控制台入控制台入控制台 ACUQITY UPLC ACUQITY UPLC 控制台控制台 2014 Waters Corporation 50 Start up Start up 界面简介(启动系统)界面简介(启动系统) 2014 Waters Corporation 51 QSMQSM的准备的准备(1)(1) ? 灌注柱塞杆清洗液(Prime Seal wash) 以下情况
27、需要做此操作Prime,例如: o新安装仪器或泵流路中溶液走干了 o当泵几小时或更长时间未用 o用过缓冲液流动相之后 ? 注意: 2014 Waters Corporation 52 注意: 为避免螺线阀座和密封垫的损坏,不要使用非挥发性的缓冲液作为Seal wash的 溶剂 为避免污染,请勿循环使用Seal wash溶剂 ? 推荐: Seal wash溶剂中有机相比例不要超过10% ? Prime Seal wash前请检查溶剂是否足够 Prime Seal washPrime Seal wash(灌注密封清洗)的步骤(灌注密封清洗)的步骤 ? 将Seal wash出口端从废液盘上摘下,连接
28、到注射器上 ? 选择 ControlPrime Sealwash,点击之 2014 Waters Corporation 53 QSMQSM的准备的准备(2)(2) ? 灌注四元溶剂管理器 用于排除泵头及管路中的气泡 用于更换从储液瓶到溶剂管理器之间的溶剂 ? 在下列情况下需要Prime四元溶剂管理器 启用新的四元溶剂管理器或新的系统 2014 Waters Corporation 54 启用新的四元溶剂管理器或新的系统 停机4小时后再次开机 更换流动相 选择选择A A、B B、C C、DD,时间设定为,时间设定为4 4分钟,按分钟,按 start start 按钮按钮 QSM 湿灌注的湿灌注
29、的湿灌注的湿灌注的步骤步骤步骤步骤 2014 Waters Corporation 55 SM FTNSM FTN样品管理器的准备样品管理器的准备 ? 做过QSM的wet prime之后,要准备样品管理器, ? 准备样品管理器包括如下步骤(新安装仪器时): 1.灌注注射器(Purge Solvent) 2.检查确认密封 (Characterizing the seal ) 2014 Waters Corporation 56 2.检查确认密封 (Characterizing the seal ) SM FTNSM FTN样品管理器的准备样品管理器的准备 2014 Waters Corporat
30、ion 57 灌注灌注灌注灌注SM FTN注射器操作注射器操作注射器操作注射器操作 2014 Waters Corporation 58 ? 选择 “ Wash Solvent”,设定时间为15秒 ? 选择 “ Purge Solvent”,设定5-7个循环 ? 单击 OK. 当系统状态是 “Idle(待机)” ,就表示灌注已经完成 ? 提示: 每做一次灌注大约需要24分钟 灌注灌注SMSM注射器和进样针注射器和进样针 ? 灌注进样针和样品注射器的目的是: 准备样品管理器 冲洗里面的进样针 排除管路中的气泡 ? 注:在灌注过程中,用溶剂充满进样针,在改变溶剂,或者排除管路中的 气泡时,需进行灌
31、注进样针和样品注射器 2014 Waters Corporation 59 气泡时,需进行灌注进样针和样品注射器 ? 提示: 确保用于灌注的溶剂有合适的组成,它应该是高纯的,并且几种溶剂是互溶的 所有的试剂瓶都要使用滤头, 并确保溶剂体积足够用于做灌注,例如,作5次灌注, 每种溶剂要用去大约20 mL ? 要求: 在检定密封之前必须先完成对样品管理器的灌注 选择清洗进样针的溶剂 ? 洗针液的选择取决于样品和所使用的流动相,确保流动相和缓冲液是 互溶的。 ? 不推荐缓冲盐作为Purge Solvent(清除溶剂) 清除溶剂:主要功能是清除进样通道中的样品清除溶剂还用于灌注样 2014 Water
32、s Corporation 60 清除溶剂:主要功能是清除进样通道中的样品。清除溶剂还用于灌注样 品注射器和进样流路。只有在自动稀释时才会进入色谱柱,此时它用 作稀释溶剂 启动TUV(PDA)检测器 ? 确保检测池中充满溶剂并且没有气泡.如果检测池中有气泡,检测器就 不能很好的初始化,并有可能损坏检测池 ? 打开检测器电源. 检测器会发出嘀嘀嘀三声响,并进行一系列自检.电 源和氘灯的指示灯都会不停地闪烁。初始化大概需要2分钟。灯预热 2014 Waters Corporation 61 源和氘灯的指示灯都会不停地闪烁。初始化大概需要2分钟。灯预热 大概需要3分钟 ? ? 当指示灯常绿不闪烁时,
33、通过监测控制台来测量和观察信号。要得到好 的数据,需要30分钟的时间平衡检测器和稳定基线 快速更新可编入样品组方法快速更新可编入样品组方法 2014 Waters Corporation 62 运行样品组方法运行样品组方法 2014 Waters Corporation 63 器具使用通则器具使用通则 ? 总是使用清洁的玻璃器皿(瓶子, 量筒或溶剂过滤装置),并在用前冲洗干 净。 ? 尽量保持一组溶剂瓶和玻璃器皿专用于ACQUITY UPLC 系统。 ? 决不要用其他实验室(例如微生物实验室等)的玻璃器具来冲洗你的玻璃容 2014 Waters Corporation 64 器。 ? 溶剂瓶要
34、贴上注明流动相配制日期的标签。 ? 不要往系统上的流动相瓶中“添加”流动相。 ? 每24-48小时制备新鲜的水相流动相,尤其是100% 含水流动相。 ? 系统上的溶剂瓶要用合适的瓶盖盖好。 有机和水相流动相有机和水相流动相 ? 只使用真正的 HPLC 最高级别的有机溶剂,推荐的最佳品牌是Fisher ? 检查溶剂是否已过滤,是否是用0.2um PTFE/GHP 膜过滤的 ? 只用经过过滤系统滤过的水,18M-cm 并经 0.2um 滤膜滤过 ? 推荐使用由 Milli-Q A10 纯水装置制备的水 ? 用高质量的盐或化学品制备缓冲盐流动相并用0.2um 滤膜过滤 2014 Waters Cor
35、poration 65 ? 用高质量的盐或化学品制备缓冲盐流动相并用0.2um 滤膜过滤 ? 不建议使用瓶装饮用水 推荐的溶剂推荐的溶剂/ /样品稀释剂样品稀释剂 ? 甲醇 ? 超纯水 ? 乙腈 ? 异丙醇 ? 乙醇 二甲基亚砜 2014 Waters Corporation 66 ? 二甲基亚砜 ? N,N-二甲基甲酰胺 不建议使用的溶剂不建议使用的溶剂/ /样品稀释剂样品稀释剂 ? 二氯甲烷 ? 氯仿 ? 乙酸乙酯 ? 氯化溶剂类(例如三氯苯) ? 甲苯 5%的强酸 2014 Waters Corporation 67 ? 5%的强酸 选择适合的选择适合的UPLCUPLC样品瓶样品瓶 ?
36、样品瓶是UPLC 分析中易被忽视的地方 ? 使用不当往往会使SM出现进样针故障 ? 是造成定量不准的重要因素 ? 是色谱图质量不佳的影响因素 ? 提示: 测试样品与样品瓶的兼容性 2014 Waters Corporation 68 测试样品与样品瓶的兼容性 一些化合物可能会与样品瓶作用,或者吸附在样品瓶表面 用于用于 ACQUITY HACQUITY H- -Class Class 系统的样品瓶系统的样品瓶 2014 Waters Corporation 69 ACQUITY UPLC HACQUITY UPLC H- -ClassClass 使用技巧故障排除、维护使用技巧故障排除、维护 2
37、014 Waters Corporation 70 使用技巧故障排除、维护使用技巧故障排除、维护 2014 Waters Corporation 71 执行执行UPLCUPLC分析时请遵循以下一般建议分析时请遵循以下一般建议 ? 使用高质量的溶剂、缓冲剂和添加剂(HPLC或MS级)。 ? 使用高质量的水( HPLC或MS级)。 ? 总是使用溶剂瓶管路上的溶剂过滤器。 ? 使用0.2微米的滤膜过滤缓冲剂。 ? 保存浓缩的储备溶液,以便制备工作溶剂时使用。 请勿向旧缓冲剂中添加新配制的缓冲剂否则可能会加快微生物生长 2014 Waters Corporation 72 ? 请勿向旧缓冲剂中添加新配
38、制的缓冲剂,否则可能会加快微生物生长。 ? 请勿使用脱气机排放管堵塞,如有必要,休整管路。 ? 不要将废液或脱气管浸入液体中。(参阅ACQUITY UPLC H-CLass四元 溶剂管理器操作员概述和维护信息了解关于如何布置管路的详细信息。) ? 使所有溶剂管路保持灌注。 ? 使用后,立即用水冲洗掉系统中的缓冲剂。 ? 如果系统长时间(大于24小时)处于空闲状态,则使用10-20%的有机溶剂 水溶剂作为“存储”溶剂。 执行执行UPLCUPLC分析时请遵循以下一般建议(续)分析时请遵循以下一般建议(续) ? 使密封清洗管路爆出灌注。 ? 在“系统启动”时灌注溶剂管路。 ? 监视废液的液位以确保其
39、不会过高。 ? 含有有机组分(例如0.1%)的起始梯度与含0%有机物的起始梯度相比, 能够提供更一致和可预计的梯度组成。 ? 希望循环时间较短时使用“提前加入”选项 2014 Waters Corporation 73 ? 希望循环时间较短时,使用提前加入选项。 ? 当碱性残留问题的故障排除时,请勿使用“提前装入”或“定量环离线” 选项。 ? 安装或拆除色谱柱时,务必将主动预加热器的可重复使用接头固定到位。 旋转色谱柱或可选的在线过滤器可进行安装或拆除。 建议建议 ? 对于初始评估,请使用完全相同的流动相:pH、改性剂、离子强度、有机 溶剂和百分比组成。 ? 保持色谱柱温度与流动相不变。通过预加热确保温度一致。 ? 根据色谱柱体积缩放进样体积,但使用的样品浓度和稀释剂应完全相同。 缩放进样体积可防止色谱柱过载。 指导原则:进样体积应小于色谱柱体积的5%。而理想的进样体积应该小于色谱 2014 Waters Corporation 74 指导原则:进样体积应小于色谱柱体积的5%。而理想的进样体积应该小于色谱 柱体积 的1%。 ? 按色谱柱直径的平方成正比例调节流速,保持线速度常数。用Waters Prep Calculator(Waters制备计算器)(部件号 720001457)确定质 量负载、进样体积、流速和色谱柱体积。
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