学号:1314709307姓名:alex班级:2010级药物制剂.doc
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1、分类号: 学校代码:10392学号:1314709007福建医科大学本科生毕业论文基于核酸适配体-DNA长链结构的ATP传感器的构建Construction of ATP sensor aptamer long chain structure based on -DNA所 在 学 院:药学院学 生:柴智强指 导 教 师:翁少煌研究起止日期:2014年1月至6月二一四年六月目录目录1英文缩写字表2中文摘要2第一部分 前言5第二部分 实验方法与结果61.实验仪器与试剂61.1主要仪器61.2 主要试剂和材料71.3 溶液配制82.实验方法92.1实验原理92.2实验流程102.2.1 杂交反应10
2、2.2.2 荧光测定103.实验结果与讨论113.1 方法的可行性分析11 3.3实验测定条件的选择113.3.2不同的反应时间所测得荧光强度123.3.3工作液用量对体系荧光强度的影响123.3.4 不同反应温度所测得的荧光强度133.4目标DNA杂交线性及检测限163.5结论18参考文献19致 谢19英文缩写字表英文缩写英文全称中文SG ISYBR Green II型绿色SYBRssDNAsingle sequence DNA单链DNAdsDNAdouble sequence DNA双链DNAP-1Probel-1一号探针P-2Probel-2二号探针TETris-EDTATris-EDT
3、A缓冲液FFluorescence intensity荧光强度ATPAdenosine triphosphate三磷酸腺苷中文摘要 本文中,应用核酸染料SYBR Green I(SGI)和ATP适配体建立荧光型传感器用于ATP浓度的测定。该方法是基于SGI可嵌入双链DNA(该双链DNA是ATP适配体杂交而来)中而产生强烈的荧光,SGI游离时不能产生荧光或荧光非常弱,而与双链DNA嵌合时才能产生强烈的荧光。这种嵌合体可与不同浓度的ATP发生反应,破坏了DNA的双链结构,进而使SGI游离出来,从而导致荧光减弱,利用该原理可以测定ATP的浓度。在优化的实验条件下,荧光信号的减弱比(F-F0)/F0
4、与不同的ATP浓度在105000 M浓度范围内呈良好的线性关系,线性方程为Y=1.11928+0.0014*X R=0.9964,检测限为6.12 M。该方法对液体环境中ATP的定量检测显示出良好的选择性和较高的灵敏度。Abstract In this paper, the application of nucleic acid dye SYBR Green I (SG I) and ATP aptamer based fluorescence sensor for determination of ATP was developed. SGI can embed into double st
5、randed DNA (based on the double stranded DNA is ATP aptamer hybrids from) and produce strong fluorescence, SG I the dye free cannot produce fluorescent or fluorescence is very weak, and produce strong fluorescence and to double stranded DNA chimeric, this chimera can react with different concentrati
6、ons of ATP, destroying the double chain structure of DNA, and the SG I free, leading to fluorescence decrease, concentration of the theory can be determined for various environment ATP. Under the optimized experimental conditions, the fluorescence signal weakening ratio (F-F0) of /F0 and different A
7、TP concentration was linear in the concentration range of 105000 M, the linear equation was Y=1.11928+0.0014*X R=0.9964, the detection limit is 6.12 M. Quantitative detection of ATP in the liquid environment of the method showed good selectivity and high sensitivity. 关键词:荧光型传感器,SYBR Green I,ATP,适配体第
8、一部分 前言腺嘌呤核苷三磷酸(ATP),是一种不稳定的高能化合物,由1分子腺嘌呤,1分子核糖和3分子磷酸组成。ATP是生物体内部与外界进行物质和能量交换过程中起着重要的桥梁、纽带作用,它还是生物体各种生命后动能量的直接来源,因此在很多的生物反应检测中ATP都是一项重要的检测内容。目前,ATP的检测方法比较多,如生物发光法等,但现有的方法存在较多不足,比如操作复杂、费时,价格昂贵以及灵敏度不够高等。因此,发展一种新的,便捷,便宜的新型ATP检测方法具有重要的意义。荧光光谱具有操作简单、检测快、灵敏度高、选择性高、重现性好、有望进行高通量生物分析的优点,广泛用于生物生化分析10,11。但是目前报道
9、的荧光生物传感器通常需要在探针上修饰增强或猝灭荧光的标记物,标记技术增加检测成本。目前,开发便捷、免标记的荧光生物传感器用于检测各种不同的目标分子已成为研究热点之一。近年来涌现出了大量的免标记物的荧光型生物传感器,包括极具代表性的DNA结构选择性结合荧光染料SGI12。运用SGI检测特异的核酸序列是分子生物学中极具意义的方法之一,例如溶液中dsDNA的定量检测以及RT-PCR。SGI特殊的结构与性质相关性使得应用SGI构建新型检测方法具备明显的优越性,包括良好的光物理性质,温度稳定性,以及对dsDNA的高选择性和高灵敏性13。本文中,基于核酸适配体-DNA长链结构的ATP传感器应用核酸染料SG
10、I和DNA适配体检测的荧光型传感器的方法。该方法是利用了SG I对于dsDNA的高选择性和高灵敏度以及SG I嵌入dsDNA而产生强烈荧光信号的原理10。设计识别ATP的核酸适配体探针与其互补序列形成长链的DNA,长链DNA与SYBR Green I形成嵌合体产生强烈荧光;加入ATP,由于ATP与适配体的特异性结合,破坏长链DNA的双链结构从而使得嵌合体中的DNA和SGI游离出来,导致荧光强度大幅度降低,并且降低幅度与加入的ATP的浓度呈现良好的线性关系。综上所述,应用SYBR Green I和基于核酸适配体-DNA长链结构的ATP传感器能快速、灵敏、经济地对ATP的浓度进行检测,并有望应用到
11、多种不同的领域,具有非常广阔的发展前景。 第二部分 实验方法与结果(一) 实验仪器与试剂1.1主要仪器:Cary Eclipse 荧光分光光度计Agilent 公司pHS-3B型精密酸度计上海雷磁仪器厂移液器(1000-5000 l)Dragon公司移液器(2-20l,20-200 l)德国BRAND移液器(0.5-10 l)美国ThermoPHG-9077A型电热恒温干燥箱上海精宏实验设备有限公司HM-1F型漩涡振荡器日本AS ONENeofuge23R台式高速冷冻离心机力康发展有限公司BS110S电子分析天平 德国 Sartorius公司Milli-PORE去离子水机Millipore公司
12、HH-2C数显恒温水浴锅常州国华电器有限公司KQ-400KDE高功率数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司1.2 主要试剂和材料Tris-hcl上海国药集团化学试剂有限公司AREDTA上海国药集团化学试剂有限公司ARNaCl 上海国药集团化学试剂有限公司ARNaOH 上海国药集团化学试剂有限公司ARSYBR Green I北京鼎国生物技术有限公司灭菌注射用水福州海王福药制药有限公司探针由生工生物工程(上海)股份有限公司的合成 Probel-1 5-ACC TGG GGG AGT ATT GCG AG GAA GGT -3 ;Probel-2 5-ATA CTC CCC CAG GTA CCT
13、 TCC TCC GCA -31.3 溶液配制(1) Probel溶液的制备:合成的ssDNA以冻干粉的形式存在,在空管中以粉雾状存在,打开时极易散失,故溶解前,先将装有DNA的离心管在离心机离心10min(3000 r/min)后,慢慢打开盖子,用TE溶液(有10 mmol/L Tris+1 mmol/L EDTA+1 mmol/L NaCl制得)溶解成所需浓度(100 mol/L)即可。为了避免反复冻融,可将储备液进行分装 (每EP管4 l),冷冻保存,便于日后取出使用。 (2) SGI dye储备液:SGI dye原液是无水二甲亚砜(DMSO)配制的10000倍浓缩液,为避免污染和反复冻
14、融,可先将装有SGI dye的离心管在离心机离心10min (3000r/s)后,慢慢打开盖子,将原液进行分装,-20避光冻存。(3) Tris-HCl缓冲液:按1 mol/L NaCl+2 mmol/L MgCl+20 mmol/L Tris-HCl的浓度配比即可获得所需体积的Tris-HCl缓冲液,最后调PH至7.6。实验用水为去离子水,4保存。(4) 不同浓度ATP溶液的配置:根据所需的ATP浓度计算配制100 mL溶液时所需的ATP的质量,然后加入Tris-HCl缓冲液,定容至100mL,即得不同浓度ATP溶液,4保存。(5) SGI dye 工作液:取2 L SG I dye储备液离
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