第三章高效液相色谱法.ppt
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1、第三章 高效液相色谱法,(HPLC),高效液相色谱法: 特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上,采用了高压泵、化学键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实 验技术建立的一种液相色谱分析法。 高压:150-350*105 Pa 高效:大于30000塔板/米 高灵敏:10-9g (紫外检测)、10-11g (荧光检测),3-1 高效液相色谱法的特点,高效液相色谱法与经典液相色谱法,经典液相柱色谱装置,高效液相色谱仪,例:分离20种氨基酸,柱长:170 cm 柱径:0.9 cm F:30 mL/h t分离: 20 h,经典柱色谱,HPLC,t分离:1 h,一、HPLC
2、与GC对比,1分析对象的区别 GC:适于能气化、热稳定性好、且沸点较 低的样品;但对高沸点、挥发性差、 热稳定性差、离子型及高聚物的样 品,尤其对大多数生化样品不可检测 占有机物的20% HPLC:适于溶解后能制成溶液的样品(包括 有机介质溶液),不受样品挥发性和 热稳定性的限制,对分子量大、难 气化、热稳定性差的生化样品及高分 子和离子型样品均可检测 用途广泛,占有机物的80%,2流动相区别 GC:流动相为惰性,气体组分与流动相无亲合作用 力,只与固定相有相互作用。 HPLC:流动相为液体,流动相与组分间有亲合作用 力,能提高柱的选择性、改善分离度,对分离起 正向作用。 3操作条件区别 GC
3、:加温操作 HPLC:室温;高压(液体粘度大,峰展宽小),二、HPLC的特点和实际应用,1、利用其高柱效(n=104片/米),有效分离极复杂 体系中的痕量组分。 2、用离子型固定相建立的离子交换色谱和离子对 色谱法分析离子型体的含量。(蛋白质、氨 基酸、常见阴阳离子等) 3、利用多孔凝胶固定相建立空间排阻色谱法可分 离高分子化合物。 4、利用手性固定相可以拆分分离具有手性的化 合物。,3-2 基本理论和条件选择,一 色谱柱柱效的基本关系式,二 分离度,三 速率方程,溶质在液相流动相中的扩散系数,约为气相中扩散系数的万分之一,2)涡流扩散项及其影响,讨论: 1)流动相流速对HPLC板高的影响(与
4、GC对比),3)传质阻力项及其影响,粘度,流动相流速对板高的影响,小颗粒填料,填充均匀; 选择较低的流动相流速; 选择粘度小的溶剂作流动相,改善传质。,修正的速率方程:,提高柱效途径,1,四、 影响分离的因素,柱效项,柱选择项,容量因子项,1. 固定相与装柱方法的选择: 选粒径小的、分布均匀的球形固定相dp10m),首选化学键合相,匀浆法装柱 2. 流动相及其流速的选择: 选粘度小、低流速的流动相甲醇,约1ml/min 3. 柱温的选择: 选室温250C左右,五、HPLC法中分离条件的选择,一、液固吸附色谱法(LSC) (liquid-solid adsorption chromatograp
5、hy) 二、液液分配色谱法(LLC) (liquid-liquid partition chromatography, chemical bonded phase chromatography 三、离子色谱法(IC) (ion-exchange chromatography and ion pair chromatography) 四、空间排阻色谱法(SEC) ( steric exclusion chromatography,3-3 高效液相色谱法的主要类型,1分离机制:利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异,分离前提:K不等或k不等,一、液固吸附色谱法(LSC) 流动相为液体,
6、固定相为固体吸附剂,2 固定相,固定相:固定相粒径(10m),(2)高分子多孔小球:YSG 原理:吸附+分配 蒹小孔凝胶作用 特点:柱选择性好,峰形好,柱效低 适用:分离弱极性化合物,3 流动相(洗脱剂),越大,表明流动相溶剂分子对吸附剂的亲和能力越强,则越易从吸附剂上将被吸附的溶质洗脱下来。,溶剂分子在单位吸附剂表面上的吸附自由能,溶剂强度参数,硅胶固定相分离苯,甲苯,乙苯,丙苯,丁苯,流动相: 干燥正庚烷,1份水饱和的正庚烷 2份干燥正庚烷,水饱和的正庚烷,改变流动相的 组成可改变分离 的选择性,4 竞争吸附平衡,Xm+nSa=Xa+nSm X 溶质分子 S 溶剂分子 如果溶剂分子吸附性更
7、强,则被吸附的溶质分子就少。 分配系数大的组分,吸附剂对它的吸附能力强,保留值就大。,5 应用,具有不同官能团的化合物 具有相同官能团,但数量不同的化合物 异构体,例:几种取代位置不同的硝基苯胺的分离。在硅胶吸附剂上的滞留顺序:,邻位间位对位,适合分离的物质,1分离机制:利用组分在两相中溶解度的差异,二、液液分配色谱法(LLC),K不仅与固定相的种类有关,也与流动相的种类有关,2固定相:载体+固定液(物理或机械涂渍法) 缺点:系统内部压力大,易流失,不实用 固定液极性NLLC 固定液非极性RLLC 3正相色谱固定液极性 流动相极性(NLLC) 极性小的组分先出柱,极性大的组分后出柱 适于分离极
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- 第三 高效 色谱
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