分子杂交ppt课件.ppt
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1、转基因水稻外源基因拷贝数检测,第二部分:分子杂交,Southern Blotting,DNA抽提,DNA酶切,酶切产物电泳,转膜,烘膜,预杂交,探针准备及标记,杂交,洗膜/显影,12,1,2,3,4,5,6,7,9,(kb),1,2,3,35,转基因植物拷贝数检测,实验原理,Hind III,probe,酶切、转膜,不同的插入拷贝产生不同大小的杂交带,H,H,H,H,植物总DNA的快速少量抽提(CTAB法),保证核酸一级结构的完整性。(3050KB) 排除其它分子的污染,不存在对工具酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子。 其它生物大分子的污染应降到最低程度。,DNA纯化的要求,分离纯化核
2、酸总的原则,CTAB是一种非离子去污剂,CTAB与核酸形成复合物,此复合物在高盐(0.7mM)浓度下可溶,并稳定存在,但在低盐浓度(0.1-0.5mM NaCl)下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀,而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后,CTAB-核酸复合物再用7075%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。,CTAB法原理:,操作步骤:,采取新鲜幼嫩叶片在研钵中用液态氮冷冻,研磨成细粉; 取约0.4g左右细粉于1.5ml离心管,加入1ml预热至95C以上的1.5CTAB,混匀; 65C水浴中放置30分钟,每隔5分钟上下颠倒混合数次 (DNase变性,促进内溶物释放); 12000
3、g离心2分钟; 吸取600l上清于新的1.5ml离心管,加入等体积氯仿/异戊醇(24:1),上下颠倒混合至下层有机相呈深绿色;,12000g离心5-10分钟; 吸取450l上清于新的1.5ml离心管,加入两倍体积95乙醇和1/10体积3M NaAc,轻轻的上下颠倒混匀至白色絮状沉淀出现 12000g离心10分钟; 弃去上清。用500l 75乙醇浸洗沉淀5分钟,除去离子及CTAB残余,12000g离心5分钟,弃上清,自然干燥; 加入50lTE(含20g/ml RNaseA),放于4C溶解; 充分溶解后,测定并调整浓度,1尽量取材幼嫩叶片,如太老,酚类物质多,必须用10mM的-ME处理 2研钵预冻
4、,粉末转管前至加CTAB前不要融化 324:1的苯酚氯仿抽提时动作应轻柔,氯仿的操作要在通风柜中进行 4实验操作戴手套 思考: (1)试分析DNA降解的可能原因 (2)提高DNA产量的措施,本实验注意事项:,氯仿/异戊醇(24:1):氯仿是有机溶剂,去除植物色素,蛋白质和多糖等,异戊醇可减少蛋白质变性过程中气泡的产生,配合使用两有机溶剂,比用单一有机溶剂去除蛋白质更有效。 DNA沉淀:无水或95的乙醇,异丙醇 3M NaAC (或10M NH4AC) 协助乙醇沉淀DNA。 75% 乙醇去除微量Na+、K+、Mg2+等阳离子及小分子量的有机分子,洗脱CTAB,所用到的试剂及作用,TE(1mM E
5、DTA,10mM Tris.HCl pH8.0)溶解并长期保存DNA。EDTA螯合Mg2+、Ca2+等二价阳离子,从而抑制DNase等的活性。 1.5 CTAB CTAB 15 g 1 M TrisCl (pH 8.0) 75 ml 0.5 M EDTA 30 ml NaCl 61.4 g Add ddH2O to 1000 ml,外环境条件: pH8.0防止脱氨作用; 65 CTAB中DNase变性,促进内溶物释放; 离心时15以防CTAB沉淀而降低DNA量。,DNA纯度:吸光值检测:检测260nm、280nm吸光值,紫外分光光度计A260/A280=1.81.9; 1.8最佳,低于1.8说
6、明有蛋白质,大于1.8说明有RNA。 电泳检测DNA大小:琼脂糖凝胶电泳,DNA质量检测,Hoechst33258:可与纳克级的DNA结合,而几乎没有RNA亲和性,激发波长365nm,发射波长460nm。0.1g/ml Hoechst33258适用于检测500ng/ml的DNA浓度,染料增加到1g/ml,分析范围可延至15g/ml,但会降低一定的灵敏度。 缺点:更易于结合AT丰富区,对DNA组成敏感。 EB:与DNA组成无关,但不如Hoechst33258敏感,且能结合RNA,激发波长302nm,发射波长590nm。,DNA的定量,(1)荧光检测仪,1 OD50 g/ml DS-DNA 或 1
7、 OD 40 g/ml RNA or SSDNA,(2.)分光光度计,琼脂糖凝胶电泳,带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多,应用非常广泛,它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点,已成为分离和鉴定核酸的常用方法。,在pH值为8.08.3时,核酸分子带负电,在电泳时由负极向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物,在分子筛的作用下,使分子大小和构像不同的核酸分子泳动率出现较大的差异,从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料(如EB)后,在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。,实验原理:,影响DNA迁
8、移速率的因素,DNA分子大小:迁移速率U与logN成反比(N为碱基对数目)。分子越大,迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快(超螺旋线性DNA) 琼脂糖浓度:logU=logU0 Kr 胶浓度,U为迁移率,U0 为DNA的自由电泳迁移率,为胶浓度,Kr为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度,分辨不同范围的DNA Agarose: 0.5%: 1-30 kb; 0.7%: 0.8-12 kb 1.2%: 0.4-7 kb; 1.5%: 0.2-3 kb.,DNA构象:一般迁移速率超螺旋环状线状DNA单链开环。当条件变化时,情况会相反,还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。 所加电压:低电压时
9、,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好,凝胶上所加电压不应超过5V/cm 碱基组成与温度:一般影响不大4 -30 ,嵌入染料的存在:降低线性DNA迁移率,(不提倡加在电泳液中) 电泳缓冲液的组成及其离子强度:影响DNA的迁移率,无离子存在时,核酸基本不泳动,离子强度过大产热厉害,熔化凝胶并导致DNA变性,一般采用1TAE,0.5TBE,1TPE(均含EDTA pH8.0),实验步骤:,用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好,水平放置在工作台上; 调整好梳子的高度; 称取0.24 g琼脂糖于30 ml 0.5TBE中,在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解,冷却至温热时倒胶; 凝胶凝固后
10、,小心拔去梳子,撕下胶带;,将电泳样品与上样缓冲液混合后将样品依次点入加样孔中; 将制胶板放入电泳槽中,加入电泳液,打开电泳仪,使核酸样品向正极泳动(注意点样孔在电泳槽的负极一端); 电泳完成后切断电源,取出凝胶,放入0.5 g/ml的溴化乙锭(EB)中浸泡1015 min,在紫外透射仪上观察电泳结果并照相记录。,电泳指示剂:核酸电泳常用的指示剂有两种,溴酚蓝(bromophenol blue, Bb)呈蓝紫色;二甲苯晴(xylene cyanol, Xc)呈蓝色,它携带的电荷量比溴酚蓝少,在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。,1. 含甘油或蔗糖,利于DNA样品沉入点样孔中 2. 含有电泳指示剂,以
11、指示电泳的进程,上样缓冲液:,实验室常用核酸染料,EB Gel red(UniRed)/Gel green Sybr green I Sybr Green II(RNA) Gold View,EB:溴化乙锭,可嵌入DNA分子中,受紫外光激发而发出荧光,利用它可检测DNA。是诱变剂,可引起插入突变,并有中度毒性,操作时应注意防护。操作时应戴手套,尽量减少台面污染。1000贮存液(0.5mg/mL ),使用时按1:1000稀释配制染色液。 EB的去除,有特定的识别序列 ,通常为46碱基的回文对称序列。 切割位点位于识别序列内的固定位置上,切割后在5末端有磷酸基团,3末端有羟基。 切割后形成粘性末端
12、或平末端,前者又分为3突出端(如PstI)和5突出端(如EcoRI)两种 其活性发挥只需Mg2作辅酶。,II类限制性内切酶的特点,限制酶的一个活性单位(1U):原则上指在50l 反应体系中,37下,经过1小时的反应将1 g的DNA完全分解所需要的酶量。 限制酶的star活性:限制酶在某些极端非标准条件下对底物DNA的特异性可能降低,即可将与原来识别的特定DNA序列不同的碱基序列切断,这种现象叫限制酶的star活性。它的出现的频率与酶、底物及反应条件有关。,引起星星活性的主要因素: 高浓度的甘油(5); 酶过量(100U/ g); 低离子强度(pH8.0); 有机溶剂(DMSO,乙醇,乙二醇,二
13、甲基乙酰胺; 用其他二价阳离子代替Mg2+(Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+) 不同的酶对上述因素的敏感程度不同,氯化镁、氯化钠/钾、Tris盐酸盐、 巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT) 牛血清白蛋白(BSA),典型的限制性内切酶作用的缓冲体系成分包括:,注意,注意阅读商家提供的产品说明书,了解所使用工具酶的浓度和最适作用条件,不要用错了buffer和作用的温度等 涉及到酶的操作时,一律在冰上操作 使用移液器吸取酶时,tip头只能刚刚插入液面吸取 如果有多个反应,酶、buffer、水等应配制成mixture再分装 各种成分加完后应混匀,然后在离心机上短暂离心,检测DNA质量 测量DNA浓度
14、所有DNA样品的浓度调整到大致相同,限制性内切酶操作,准备:,DNA ( g) 10 l 10*buffer reaction 2 l Enzyme (10U) 1l (10U/l ) H2O 7 l 20 l,酶切体系:,注意:冰上操作,1 5 DNA 10 l (ddH2O) Hind (10U/l) 1 l 5 l 10buffer 2 l 10l ddH2O 7 l 35 l Total 20 l,37C 酶切过夜,酶切体系,混匀分装,电泳检测酶切效率:每样品1/10量上样,电泳检测。 若呈现均匀连续分布的一片,则酶切效果好,否则重做 。 出现切烂:DNA降解,重新提DNA; 切不动:
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