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1、第三章 DNA复制,DNA Replication,Watson & Crick:一种遗传物质,必须能行使两种功能,即自我复制和对细胞的高度特异性的影响。,遗传物质的基本属性:自我复制 控制性状的表达 产生突变,生物体的遗传信息以密码的形式编码在DNA分子上,表现为特定的核苷酸排列顺序; 遗传信息通过DNA的复制由亲代传递给子代; DNA双螺旋模型的提出是DNA复制的理论基础。,DNA是生物遗传的主要物质基础:,复制的复杂性,DNA复制起始控制机理知之甚少,1 DNA的半保留复制 2 复制单位、起点和复制方式 3 复制速度 4 引物 5 DNA的半不连续复制,第一节 DNA的复制概述,1 DN
2、A的半保留复制(semi-conservative ),1.1 概念 复制时,DNA两条链解开,以每条链为摸板,按碱基互补配对原则合成互补链,形成的两个子代DNA分子与原来的亲代DNA分子完全相同,每个子代DNA分子中一条链来自亲本,一条链为新合成的。,1.2 实验依据: Meselson & Stahl (1958) E.coli :放射性同位素(15N)标记&CsCl密度梯度离心,DNA分子上每一条链都含有合成它的互补链所必需的全部遗传信息 半保留复制是双链DNA普遍采用的复制机制 在半保留复制中碱基配对是核酸分子间传递遗传信息的结构基础 DNA分子在代谢上是稳定的,1.3 生物学意义:
3、保证DNA代谢的稳定性。经过多代的复制,子代DNA仍可以保持与最初亲本的一致性。 稳定性是相对的,变异是绝对的,2、复制单位、起点和复制方式,2.1 复制单位:复制子 A unit of the genome in which DNA contain a region from origin(复制起点) to terminus(复制终点). 基因组中能独立复制的单位 原核生物单复制子,真核生物多复制子,根据:越靠近origin 的基因转导的频率越高,4a 4b 3c 3d 2e 2f 1g 1h,复制的不同步性、断裂的随机性,replication origin:在基因a和b之间,复制起点的确
4、定实验,分子杂交确定各基因片段的频率,2.2 复制起点:一般富含AT?,单起点、单方向,多起点、单方向,单起点、双方向,多起点、双方向,2.3 复制方式:具有多样性 单起点或多起点; 单向或双向; 对称或不对称,确定复制方向实验autoradiography E.coli,实验步骤: E.coli先用低放射性的3H-dTTP标记; 几分钟后,E.coli转移入高放射性的3H-dTTP培养基中继续标记; 提取DNA进行放射自显影; 根据底片感光银粒密度的分布判断复制的方向。 结论: 单向复制 银粒的密度:一端高,一端低; 双向复制 银粒的密度: 中间低,两端高。,Different densit
5、ies of radioactive labeling can be used to distinguish unidirectional and bidirectional replication.,真核生物染色体DNA 线性双链 多复制子 病毒DNA 形态多样(环形、线形、双链或单链) 复制方式多样(双向、单向、对称或不对称) 生物染色体多为双向对称式复制 例外:Bs双向,但两复制叉移动距离不同 滚动环式(噬菌体X174DNA)和D环式(线粒体DNA)是单向复制的特殊形式。,真核生物复制叉移动的速度1000-3000bp/min; 原核生物复制叉移动的速度50,000bp/min 真核生物
6、比原核生物慢? (复制时解开核小体,复制后又重新形成核小体),3 复制速度,4、引物(primer),所有DNA聚合酶均不能起始DNA的合成,引物是一段同模板DNA配对的短核酸序列,为DNA合成提供3-OH末端,S.S. DNA virus,RF,无M13 RF,Rifampin,M13,Rifampin,有M13 RF,有M13 RF,M13,Rifampin,M13,表达、组装、释放,DNA复制需要RNA引物的发现,M13 RF的形成需要 RNA polymerase合成一段RNA分子作为引物;,RF启动后,RNA引物已经形成,Rifampin 的抑制无效。,Conclusion,The
7、first evidence supporting RNA priming,Rifampin 是E.coli RNA polymerase 的抑制剂,引物,RNA引物(多数) DNA引物 引物蛋白,OK !,How ?,5 DNA的半不连续复制( semi-discontinuous replication ),1968年,冈崎:3H-dTTP标记 + 碱性密度梯度离心:发现短时间内分离的DNA中有大量1000nt的DNA小片段;一段时间后,检测到 DNA大片段。 DNA ligase 变异的温度敏感菌株,在ligase不起作用的温度下,有大量的DNA短片段积累。 说明:DNA复制中先合成较短
8、片段(冈崎片段),再连成长链DNA。,5.1 半不连续复制的发现,冈崎片段的数量新合成DNA的一半,原因:U代替T掺入到DNA中造成。DNA中的U被糖苷酶切除,随后进行修复。此过程可产生一些小片段。 糖苷酶变异株,DNA中的U不再被切除新合成DNA一半出现于冈崎片段;另一半直接进入大的片段。 说明:DNA复制时,一条链连续,另一条链不连续。即半不连续复制。,5.2 概念:DNA复制时,前导链的合成是连续的,而后随链的合成是不连续的,这种复制方式称为半不连续复制,前导链(leading strand)DNA复制时,合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链。 后随链(lagging stran
9、d) DNA复制时,合成方向与复制叉移动的方向相反,形成许多不连续的冈崎片段,最后再连成一条完整的DNA链。 冈崎片段:DNA复制过程中,由DNA聚合酶合成的可连接为后随链的DNA短片段。 原核生物1000-2000nt(一个顺反子的长度), 真核生物100-200nt(核小体的长度)。,(n=n1 + n2 + n3 + n4),1 DNA复制的总反应 :,第二节、原核生物DNA复制,底物: dNTP(dATP,dGTP,dCTP,dTTP) 模板: 单链的DNA母链 RNA引物: 寡核苷酸 (10nt60nt) DNA聚合酶: 其他酶和蛋白因子:引物酶、解链酶,解旋酶,单链结合蛋白,连接酶
10、,2 E.coli DNA复制的酶体系,DNA聚合酶 解螺旋酶 单链结合蛋白 拓扑异构酶 引物合成酶 连接酶(岗崎片段),2.1 DNA聚合酶,催化核酸链的延长反应 以4种dNTP为底物 反应需接受模板指导 链延伸需有引物3-OH存在 链延伸方向为5-3 产物DNA极性与模板相对 需Mg离子存在,单体酶, 多功能酶。 具有5 3聚合酶功能(对dNTP的选择); 3 5外切酶活性(校对功能) 5 3外切酶活性 功能:DNA损伤的修复,DNA复制时RNA引物切除及其空隙的填补,DNA聚合酶,Arthur Kornberg (1958),Arthur Kornberg (1958),5至3 的聚合活
11、性( 5 3 ):3OH对dNTP的磷酸进行亲核攻击,形成3 ,5 磷酸二酯键。,3 5 外切酶活性:正常复制时该活性很低,一旦出现错配的碱基,聚合反应停止,35外切活性将错配的核苷酸切除-校正作用;,核酸外切酶活性,35外切酶活性: 切除错配的核苷酸,53外切酶活性: 切除引物 切除突变的片段,?,缺口平移(nick translation):DNA pol在缺口处一方面由53外切活性切除缺口下游的核苷酸,另一方面又由聚合活性从53方向合成新的DNA链,使缺口位置向3端移动。用于制备放射性标记的DNA探针。,Klenow片段:DNA pol经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大亚基,丧失53外切活性
12、;,Nick translation replaces part of a pre-existing strand of duplex DNA with newly synthesized material.,多亚基酶 具有5 3聚合酶功能,但聚合活力低; 3 5外切酶活性(校对功能) 功能:DNA损伤的修复,DNA聚合酶:,DNA聚合酶 :真正的复制酶,核心酶: 亚基有主要的聚合活性; 亚基有35外切酶活性 组建核心酶,10种22个亚基组成不对称聚合体,夹子 装配器,DNA聚合酶III全酶的亚基组成,大肠杆菌三种DNA聚合酶的比较,DNA聚合酶催化反应的特点,以单链DNA为模板 以dNTP为
13、原料 引物提供3-OH 聚合方向为53,2.2 解螺旋酶 (helicase),通过水解ATP获得能量打开DNA双链。每解开一对碱基需要水解2个ATP分子。,E.coli 解旋酶主要为:DnaB和Rep蛋白 DnaB: 沿5-3方向,结合于滞后链模板 Rep蛋白:沿3-5方向,结合于前导链模板,2.3 单链DNA结合蛋白 (SSB),与分开的单链DNA结合,防止它们再接触并重新结成碱基对,起着稳定解开的单链,阻止复性和保护单链部分不被核酸酶降解。,2.4 DNA拓扑异构酶 (topoisomerase),兼有内切酶和连接酶的活力, 既能水解,又能连接磷酸二酯键. 拓扑异构酶:使DNA一条链发生
14、断裂和再连接。作用是松解负超螺旋,反应不需要能量。 拓扑异构酶:使DNA两条链发生断裂和再连接。当引入负超螺旋时需要由ATP提供能量。,2.5 引物酶和引发体,引物酶 (primase): 依赖DNA的RNA聚合酶。 催化RNA引物的合成。 在大肠杆菌,引物酶是dna G基因的产物。 RNA引物: 在DNA模板的复制起始部位由引物酶催 化NTP的聚合,形成短片段的RNA,为DNA 聚合提供3-OH末端。,引发体 (primosome),由Dna B、Dna A、Dna C以及其他复制因子一起形成复合体,再结合引物酶形成较大的聚合体,结合到模板DNA上。 复制开始时,在引发体的下游解开双链,再由
15、引物酶催化引物的合成。,2.6、DNA连接酶(ligase),连接酶,DNA连接酶在DNA复制、修复和重组过程均起重要作用。 T4连接酶还能连接无单链粘性末端的平头双链DNA,催化双链DNA切口上5磷酸基与3羟基的共价连接。 连接反应需要能量。 不催化二条游离单链的结合。,复制叉:DNA分子的正在复制部位,同时进行着解链与合成,形成在显微镜下可看到的叉状结构,称为复制叉。 复制体:许多酶和蛋白质在复制叉上参与作用,所形成的复合物称为复制体。,3 原核生物DNA的复制,3.1、复制的起始(initiation) 复制起点处双链的解开,RNA引物的合成 3.2、复制的延长(elongation)
16、DNA聚合酶III向RNA引物3端添加dNTP,包括前导链的合成和滞后链的合成 3.3、复制的终止(termination),3.1 复制的起始,E.coli 复制起点为oriC,245 bp,其序列和控制元件在细菌中十分保守。 关键序列:3个13bp序列、4个9bp序列,许多生物的复制原点都是富含A、T的区段。,原核生物只有一个复制起点。 真核生物有多个复制起点。,起始过程 2040个DnaA蛋白(ATP)结合到9bp重复序列,形成 起始复合物; 富含AT的13bp重复序列在HU类组蛋白结合之后变性 ,形成 开链复合物; DnaB解螺旋酶在DnaC引导下结合于开链区。在DNA拓扑异构酶协助下
17、,解开DNA双链。SSB结合到被打开的单链上。形成前引发复合物。 引物酶合成一段RNA引物,并开始DNA的复制,3. 2 DNA复制的延伸,向引物的3端逐个添加核苷酸,形成DNA片段; 前导链和滞后链的合成同时进行; 由于DNA的两条互补链方向相反,却由同一个聚合酶的不对称二聚体所催化。因此,滞后链必须绕成一个突环(loop)。冈崎片段的合成需要DNA pol 不断与模板结合与脱开,此过程由复合物借助水解ATP的能力协助夹子来完成。,起始(引物体合成RNA引物) 延长(DNA聚合酶III 向引物RNA的3端逐个添加核苷酸,形成短的DNA片段) 终止(DNA聚合酶I的53外切酶活性切除RNA引物
18、,其53 的聚合酶活性填补缺口,之后由连接酶连接冈崎片段),后随链的生成包含三个步骤:,包括:引物的切除;补上相应的DNA链;通过ligase连接各个片段。 Ter有点像陷井,使复制叉只能进入,不能出来。 TUS与ter位点结合形成Tus-ter复合物,阻止复制叉继续前移 拓扑异构酶 IV分开连锁体,3.3 复制的终止,E.coli (单起点双方向),Ter-TUS复合体 终止解螺旋酶的作用 防止DNA过度复制,避免 出现DNA多聚体,E.Coli染色体DNA的复制调控,染色体复制与细胞分裂一般同步 复制起始不依赖细胞分裂,但终止能印发细胞分裂 DNA复制调节主要发生在起始阶段 Dam甲基化酶
19、使腺嘌呤6-N甲基化 复制起点需被甲基化才能起始复制,第三节 真核生物DNA的复制,1、细胞周期 DNA合成前期(G1):合成DNA复制所需要的蛋白质和RNA; DNA合成期(S):常染色质早复制,异染色质晚复制,着丝粒和端粒的DNA最后复制。 DNA合成后期(G2):有丝分裂的准备期; 有丝分裂期(M);,其中G1、S 、G2合称为间期,为M期作准备,S 6-8h,2、真核生物DNA复制的酶和蛋白,2.1 真核生物DNA pols,哺乳动物DNA聚合酶,存在于细胞核,起始新链的合成(前导链、滞后链) 多亚基酶(一般为4个),其中一个亚基有引物合成酶活性(10nt RNA),一个亚基有聚合酶活
20、性(2030nt iDNA),但无3 5外切酶活性 现在认为DNA pol 只能合成引物,2.1.1、酶:引物合成酶活性,单亚基酶,位于细胞核 有聚合作用,无3 5外切酶 功能:与修复有关,2.1.2、 酶:修复,2.1.3、酶:线粒体DNA合成,2个亚基,定位于线粒体 有聚合和3 5外切酶活性 功能:参与线粒体DNA合成,4个亚基; 具有聚合酶活性和35外切酶活性 其持续合成DNA的能力需要PCNA(增殖细胞核抗原,相当于原核DNA pol III的亚基,形成环状夹子夹住DNA );,2.1.4、酶:DNA复制;,在一个复制叉上,有一个DNA聚合酶,2个DNA聚合酶或1个DNA聚合酶和一个D
21、NA聚合酶 在复制叉上,前导链由DNA聚合酶合成,滞后链由DNA聚合酶或DNA聚合酶合成。,2.1.5、酶:可能合成滞后链,2.2 其它酶和蛋白质因子,增殖细胞核抗原(PCNA):进行性因子, 可形成环状夹子夹住DNA。 复制因子C(RF-C): 定位因子,是夹子装置器(clamp loader),帮助PCNA因子安装到双链上以及拆下来。 RF-A:单链DNA结合蛋白。 T抗原:DNA解旋酶。 拓扑异构酶II: 消除拓扑张力。 DNA连接酶I:冈崎片段的连接。 RNaseH1和MF-1:去除RNA引物,3、真核生物DNA复制,3.1 复制过程及相关实验系统 起始位点 酵母为实验系统 延伸 SV
22、40为实验系统 端粒,起始位点-酵母为实验系统,具有多个复制单元,各自有1个复制起始位点 酵母里的复制起始位点为ARS(automatic replication sequence) ARS含11bp的保守序列,富含AT,可以被复制起始相关的蛋白质识别 ( ORC(origin recognition complex) is a complex of 6 proteins with a mass of 400 kD ) 复制单元没有固定的终止位点。,延伸 -SV40为实验系统,解螺旋酶在特定复制原点上解开螺旋,具有启动功能的DNA pol-引物酶在复制叉上合成一小段引物。 前导链和滞后链由DN
23、A pol 参与复制,滞后链上RNA引物由RNaseH1和MF-1去除,然后由DNA pol 和DNA连接酶I修复滞后链。 需各种辅助蛋白PCNA、RF-A、RF-C、 T抗原、拓扑异构酶II、DNA连接酶I和RNaseH1和MF-1的参与。,终止,复制单元没有固定的终止位点 端粒,组蛋白的复制-全保留复制 真核DNA冈崎片段200bp = 核小体DNA的长度真核DNA复制以核小体为单位进行; 放射性同位素标记 核小体的组蛋白或是全部带有标记,或是全部不带同位素标记 亲代核小体的组蛋白八聚体是以整体传递给子代DNA; 药物抑制蛋白质合成 前导链产生核小体结构,滞后链没有核小体结构 前导链的组蛋
24、白完全来自亲本,而滞后链则完全是新合成的。,2 原核生物与真核生物的复制异同,相同点 不同点,DNA复制的共同特点,半保留:最基本特征,对生物遗传意义重大 半不连续:前导链、滞后链、冈崎片段 都存在:引发、延长、终止 方向:53 都需要相应的功能蛋白、酶及RNA引物的参与,DNA复制的不同特点,真核生物: 大、核小体、染色质 速度比原核生物慢 多复制起点 染色体复制完成前,复制起点不重新复制 端粒,3-OH,Lagging strand of circle DNA replication,Lagging strand of linear DNA replication,But,3-OH ?,3
25、-OH ?,The ends of linear DNA are a problem for replication,染色体末端与特定端粒蛋白质因子,氢键、范德华力复合物 保护端粒DNA末端不受外切核酸酶及单链特异性内切核酸酶破坏 避免DNA黏性末端裸露而发生染色体融合 可能与真核生物染色体线形末端的复制有关,3.2 端粒(tolemere),端粒:真核生物染色体末端具有的特殊结构,结构简单、相似 序列具有一定取向特征: -5末端富含C, 3末端富含G -富含G的 3-OH端有一条核苷酸单链突出末端,端粒(telomere)的复制 特点:存在于染色体两端,由数百个简单重复序列构成的,富含GC,
26、但不含有遗传信息,且3端长于5端 作用:保护染色体末端不被酶降解 解决染色体复制时末端丢失的问题 可能与细胞衰老有关,端粒酶(telomerase),含有RNA(含端粒重复单位的模板)的蛋白酶 由RNA与蛋白质组成的一种核糖体蛋白复合体 具逆转录酶活性 可外加重复单位到5末端,维持端粒长度 分子机制还未清楚,TTGGGGTTGGGGTTGGGG,5,5,TTGGGGTTGGGGTTGGGG,5,TTGGGGTTGGGGTTGGGG,2.聚合,1. 结合,3.移位,爬行模式,TTGGGG,TTGGGG,4 真核生物复制调控,三个调控水平 A 细胞生活周期水平调控 细胞生长期 B 染色体水平调控
27、决定不同染色体或同一染色体不同部位的复制子按一定顺序在S期起始复制 C 复制子水平调控 复制子,决定复制起始与否,1、DNA复制的特点,半保留:最基本特征,对生物遗传有重要意义; 半不连续:前导链、滞后链、冈崎片段; 方向:53; 复制方式具有多样性:单向/双向(更常见); 需要RNA引物。,总结,2、DNA聚合酶催化反应的特点: 以四种脱氧核糖核酸(NTP)为底物; 反应需要接受模板指导; 反应需要有引物OH存在; DNA链的生长方向为; 产物DNA的性质与模板相同。,3、DNA合成高保真性的因素,DNA聚合酶对底物的选择作用; DNA聚合酶3 5核酸外切酶的校对作用; 修复系统对错配碱基的检查和DNA各种损伤的修复 复制叉的复杂结构进一步提高了复制的精确性;,4、细菌和真核生物复制体的组成,5、原核生物与真核生物DNA复制的区别,学习要求,掌握半保留复制,不连续复制的概念; 掌握重要的实验及其说明的问题; 掌握DNA聚合酶催化的反应,复制高保真性依赖的机理; 掌握DNA解链酶,拓扑异构酶,引物酶及DNA 连接酶催化的反应; 掌握DNA复制的基本特点; 归纳并掌握原核生物和真核生物复制的区别,
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