第十六章色谱分析法概论.ppt
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1、第十六章 色谱分析法概论 chromatography,色谱法的分类和发展 色谱过程和基本原理 基本类型色谱方法及其分离机制 色谱法基本理论,高分离效能 高灵敏 高选择性 分析速度快 应用范围广,色谱法的特点:,色谱学的重要作用,诺贝尔化学奖:1948年,瑞典Tiselins,电 泳和吸附分析;1952年,英国马丁(Martin)和辛格(Synge),分配色谱。 应用的科学领域:生命科学、材料科学、环 境科学等。(科学的科学) 药学(药物分析):各国药典收载了许多色 谱分析方法。中国药典二部,700多,纯 度检查、定性鉴别或含量测定,一部,600多鉴别或含量测定。,第一节 色谱法的分类和发展,
2、一、色谱法的分类 按流动相的分子聚集状态分类: GC、LC、SFC 等。 按固定相的分子聚集状态分类: GSC、GLC、LSC、LLC等。,按操作形式分类: 柱色谱法、平面色谱法、毛细管电泳法等。 按色谱过程的分离机制分类: 分配色谱法、吸附色谱法、离子交换色谱法、空间排阻色谱法、毛细管电泳法等。,二、色谱法的发展 (一)色谱法的历史 (二)色谱法的现状和发展趋势 1新型固定相和检测器的研制 2色谱新方法的研究 3色谱联用技术 4色谱专家,第二节 色谱过程和基本原理,一、色谱过程 实现色谱操作的基本条件是必须具备相对运动的两相,固定相(stationary phase)和流动相(mobile
3、phase)。 色谱过程是组分的分子在流动相和固定相间多次“分配”的过程。,色谱过程,组分的结构和性质微小差异 与固定相作用差异 随流动相移动的速度不等 差速迁移 色谱分离。,二、色谱流出曲线和有关概念,色谱流出曲线 是由检测器输出的电信号强度对时间作图所绘制的曲线,又称为色谱图。 基线 是在操作条件下,没有组分流出时的流出曲线。基线反映仪器 (主要是检测器) 的噪音随时间的变化。 色谱峰 是流出曲线上的突起部分。 正常色谱峰、拖尾峰和前延峰,对称因子fs (symmetry factor) : 衡量色谱峰的对称性,到20页,到19页,保留时间(retention time;tR):从进样到某
4、组 分在柱后出现浓度极大时的时间间隔。 死时间(t0):分配系数为零的组分,即不被固 定相吸附或溶解的组分的保留时间。 调整保留时间( ):某组分由于溶解(或被吸附)于固定相,比不溶解(或不被吸附)的组分在柱中多停留的时间。,定性参数1,定性参数4 保留指数(retention index;I) : 在GC中,以正构烷烃系列作为组分相对保留值的标准,用两个保留时间紧邻待测组分的基准物质来标定组分,这个相对值称为保留指数,又称Kovats指数,定义式:,z与z+n为正构烷烃对的碳原子数 ,Z为6,7,8,I为600,700,800,定量参数 峰高(peak height;h):组分在柱后出现浓度
5、极大时的检测信号,即色谱峰顶至基线的距离。 峰面积(peak area;A):色谱曲线与基线间包围的面积。,返回,返回,柱效参数 标准差(standard deviation;):正态色谱流出曲线上两拐点间距离之半,即0.607倍峰高处的峰宽之半。的大小表示组分被带出色谱柱的分散程度。越大,组分越分散;反之越集中。 半峰宽(W1/2):峰高一半处的峰宽 W1/2=2.355 峰宽 (peak width;W):色谱峰两侧拐点作切线在基线上所截得的距离。 W=4 或 W=1.699W1/2,总分离效能指标 分离度(resolution;R):又称分辨率。是相邻两色 谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽
6、均值之比。,分离度,设正常峰,W1W2= 4 , 则R=1.5时,99.7%面积(tR 3)被分开, tR =6 ,称 6 分离 。,三、分配系数与色谱分离,(一) 分配系数和容量因子 分配系数 (distribution coefficient;K) 是在一定温度和压力下,达到分配平衡时,组分在固定相 (s) 与流动相 (m) 中的浓度 (C) 之比。,分配系数仅与组分、固定相和流动相的性质及温度(和压力)有关。是组分的特征常数。,容量因子(capacity factor;k):在一定温度和压力下,达到分配平衡时,组分在固定相和流动相中的质量(m)之比。(摩尔数?) 又称为质量分配系数或分配
7、比。,分配系数与色谱分离,还与固定相和流动相的体积有关。,容量因子与 分配系数的关系,分配系数与色谱分离,(二)分配系数和容量因子与保留时间的关系,(三)色谱分离的前提,KAKB 或kAkB 是色谱分离的前提。,分配系数与色谱分离,推导过程:,第三节 基本类型色谱方法及其分离机制,分配色谱法 吸附色谱法 离子交换色谱法 空间排阻色谱法,一、分配色谱法,分配色谱法,分离原理 利用被分离组分在固定相或流动相中的溶解度差别而实现分离。,溶质分子在固定相中溶解度越大,或在流动相中溶解度越小,则K越大。在LLC中K主要与流动相的性质 (种类与极性) 有关;在GLC中K与固定相极性和柱温有关。,分配色谱法
8、,固定相 又称固定液(涂渍在惰性载体颗粒上的一薄层液体;化学键合相(通过化学反应将各种有机基团键合到载体上形成的固定相)。,流动相 气液分配色谱法:气体,常为氢气或氮气。 液液分配色谱法:与固定相不相溶的液体。 正相液液分配色谱:流动相的极性弱于固定 相的极性。 反相液液分配色谱:流动相的极性强于固定 相的极性。,分配色谱法,洗脱顺序 由组分在固定相或流动相中溶解度的相对大小而决定。,正相液液分配色谱:极性强的组分后被洗脱。(库仑力和氢键力)。,反相液液分配色谱:极性强的组分先出柱。,二、吸附色谱法,分离原理 利用被分离组分对固定相表面吸附中心吸附能力的差别而实现分离。 吸附过程是试样中组分的
9、分子(X)与流动相分子(Y)争夺吸附剂表面活性中心的过程,即为竞争吸附过程 。,吸附系数与吸附剂的 活性、组分的性质和 流动相的性质有关。,吸附色谱法,固定相 多为吸附剂,如硅胶、氧化铝。 硅胶表面硅醇基为吸附中心。 经典液相柱色谱和薄层色谱:一般硅胶 高效液相色谱:球型或无定型全多孔硅 胶和堆积硅珠。 气相色谱:高分子多孔微球等,吸附色谱法,流动相 有机溶剂(硅胶为吸附剂) 洗脱能力:主要由其极性决定。 强极性流动相占据吸附中心的能力强,洗脱能力强,使k值小,保留时间短。 Snyder溶剂强度o:吸附自由能,表示洗脱能力。o值越大,固定相对溶剂的吸附能力越强,即洗脱能力越强。,表 16-1
10、一些溶剂在硅胶上的o值,洗脱顺序 ka=KaSa/Vm 在色谱柱(Sa与Vm一定)时,Ka大的组分保留强,后被洗脱,Ka小的组分在吸附剂上保留弱,先被洗脱。 Ka与组分的性质(极性、取代基的类型和数目、构型有关)。,吸附色谱法,以硅胶为吸附剂:极性强的组分吸附力强。 饱和碳氢化合物为非极性化合物,不被吸附。基本母核相同,引入的取代基极性越强,则分子的极性越强,吸附能力越强;极性基团越多,分子极性越强 (但要考虑其他因素的影响) 。 不饱和化合物的吸附力强,双键数越多,吸 附力越强。 分子中取代基的空间排列,分离原理 利用被分离组分离子交换能力的 差别而实现分离。 分为阳离子交换色谱法和阴离子交
11、换色谱法。 阳离子交换: 阴离子交换: 离子交换通式:,三、离子交换色谱法,离子交换色谱法,交换反应的平衡常数即选择性系数:,KA/B是离子对树脂亲和能力相对大小的度量,KA/B越大,A的交换能力大,越易保留。 常选择某种离子(如H+或Cl)作参考。 KA、 KB为A、B的分配系数。,离子交换色谱法,固定相 离子交换剂(ion exchanger):离子交换树脂(resin)和硅胶化学键合离子交换剂。 离子交换树脂: 有网状骨架及可离解、可交换基团,如磺酸基 (SO3H) 、羧基 (COOH) 及季胺基 (NR3+OH) 等。性能指标常用交联度、交换容量和粒度等。 化学键合离子交换剂:键合在薄
12、壳型和全多孔微粒硅胶上。用于HPLC中的固定相,离子交换色谱法,流动相 一定pH和离子强度的缓冲溶液,有 时也加入少量有机溶剂,如乙醇、四氢呋 喃、乙腈等,以提高选择性。,离子交换色谱法,影响保留行为的因素 被分离离子、离子交换 剂、流动相的性质等 (1) 离子的电荷和水合半径:价态高选择性系数大。同价阳离子在酸性阳离子交换剂上,水合离子半径, 选择性系数小。 稀溶液中阳离子在强酸性阳离子交换树脂上的交换顺序是: Fe3+Al3+Ba2+Pb2+Sr2+Ca2+Ni2+Cd2+Cu2+Co2+Mg2+Zn2+Mn2+Ag+Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li+,离子交换色谱法,常见阴离子在强
13、碱性阴离子交换树脂上的交换顺序通常为: 柠檬酸根PO43SO42I SCN Cl CH3COOOHF,保留顺序?洗脱顺序?,离子交换色谱法,(2)离子交换剂的交联度和交换容量:在一定的范围内树脂的交联度越大,交换容量越大,则组分的保留时间越长。 (3)流动相的组成:交换能力强的离子组成的流动相有较强的洗脱能力。流动相的离子强度高,使组分的保留值降低。 流动相的pH:溶质的离解受到抑制则保留时间变短。弱离子交换树脂的交换容量在某一pH值有极大值。,四、空间排阻色谱法,分离原理 根据被分离组分分子的线团尺寸进行分离。 也称为分子排阻色谱法。,空间排阻色谱法,根据空间排阻(steric exclus
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