第十九部分补体检测及应用.ppt
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1、第十九章 补体检测及应用 第一节 概述 一、补体成分的含量与理化特性 二、补体的活化途径 第二节 补体总活性测定 第三节 单个补体成分的测定 一、免疫溶血法 二、免疫化学法 第四节 补体结合试验 一、试验原理 二、试验方法 三、方法评价 第五节 补体受体的测定 第六节 补体测定的应用 思考题 小结 第一节 概 述 补体: 具酶样活性、不耐热的糖蛋白 其存在与抗原性异物的刺激无关 在正常人血清中含量相对稳定 某些疾病时,含量及其活性可发生改变 分 类 一、 补体成分的含量与理化特性 根据补体系统的生物学功能,可将其分为: 补 体固有成分、补体调节蛋白、补体受体 (complement recep
2、tor, CR)三大部分。 补体理化性质 由肝细胞、巨噬细胞以及肠粘膜上皮细胞等多种细胞产生 均为多糖蛋白,大多数电泳迁移率属、球蛋白 含量约占血清球蛋白总量的10%,其中C3含量最高、D因 子含量最低 固有成份间的分子量差异较大,其中C1q最大、D因子最 小。 对热不稳定,56C、30min即被灭活,010 C条件下活 性只能保持34d。 多种理化因素如射线、机械振荡、酒精、胆汁和某些添加 剂等均可破坏补体 补体 成分 分子量 电泳 区带 血清含量参考值 (g/ml) 补体 成分 分子量 电泳 区带 血清含量参考值 (g/ml) C1q390270C979240 C1r9535B952102
3、40 C1s8535D252 C211712030P220225 C319011300 C1INH 150180 C41802430600C4bp1100250 C5190275I因子9350 C6128260H因子159400480 C7120255S因子88500 C81631200 经典途径 二、补体的活化途径 经典激活途径替代激活途径MBL途径 激活物质抗原抗体复合物肽聚糖、酵母多糖、脂多糖MBL相关的丝氨酸蛋白酶 起始分子C1qC3C2、C4 参与补体成分 C1、C4、C2、C3、C5- C9 C3、C5-C9、B因子、D因子C2-C9、 MASP 所需离子Ca2+、Mg2+Mg2+
4、Ca2+ C3转化酶C4b2bC3bBbC4b2b C5转化酶C4b2b3bC3bnBbC4b2b3b 生物学作用 参与特异性免疫的 效应阶段,感染后期 发挥作用 参与非特异性免疫的 效应阶段,感染早期 发挥作用 参与非特异性免疫的 效应阶段,感染早期 发挥作用 第二节 补体总活性测定 补体总活性测定方法是以红细胞的溶解为指示,以50%溶血 为判断终点,称为CH50 补体活化途径不同,应用不同的激活物可活化不同的补体 途径 基于经典途径的CP-CH50(临床常规项目) 应用于C3旁路检测的AP-CH50(尚未列入检验常规) MBL途径活性测定的可靠方法暂未建立 (一)CH50测定法的原理 应用
5、绵羊红细胞(sheep red blood cell, SRBC)和其相应 的抗体(溶血素),作为能诱导补体活化经典途径的指示物 和激活剂。补体能使溶血素特异性结合的绵羊红细胞溶解, 当溶血素和绵羊红细胞浓度恒定时,溶血程度与补体含量和 活性相关。将新鲜待检血清作不同稀释后,加入反应体系, 测定溶血程度,以50%溶血时的最小血清用量作为判定终点 ,可测知补体总溶血活性 溶血程度与补体含量的关系 在适当、稳定的反应系 统中,溶血反应与补体的 剂量依赖关系呈现“S” 形曲线 在轻微溶血和接近完全 溶血时,补体量的变化对 溶血程度的影响不大,即 溶血对补体量的依赖不敏 感。但在3070%溶血 时,补
6、体含量仅出现较小 的变动,溶血程度也会发 生较大的改变 (二)CH50测定方法 1.红细胞浓度的调整 绵羊红细胞(SRBC)采自绵羊颈静脉,制备脱纤维羊血或 用阿氏(Alsever)血液保存液制成抗凝血,4保存备用。使 用前,调制成2%5% SRBC悬液。为使红细胞浓度标准化, 可吸取少量红细胞悬液,加入2030倍的稀释液,在542nm波 长处测定吸光值以调整红细胞浓度。 2.溶血素滴定 溶血素可通过SRBC免疫家兔获得,一般无需纯化 试验前需先行加热56 30min或60 3min以灭活补体 溶血素有商品销售,可按标识效价稀释使用 自行制备的溶血素需进行滴定,确定使用浓度,在补体活 性测定中
7、,大多使用2个单位。 溶血素效价稳定,一般使用3个月后再作重新滴定 3.稀释缓冲液 4. 50%溶血标准管 5. 50%溶血总补体值的计算 (三)方法评价与临床意义 方法简便、快速,但敏感性低,补体的活性除与反应体积 成反比外,还与反应所用的缓冲液、SRBC的数量以及反应温 度有关 总补体活性的参考范围为50100U/ml CH50增高见于: 急性炎症、组织损伤、恶性肿瘤等 CH50降低见于: 系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎 、 急性肾小球肾炎等 第三节 单个补体成分的测定 常作为单个补体成分的检测指标:C3、C4、C1q、B因子和 C1酯酶抑制物等 测定方法: 免疫溶血法 (检
8、测单个补体成分的活性) 免疫化学法(检测单个补体成分的含量) 自动化免疫散射比浊法 一、免疫溶血法 定义:是根据补体参与抗体介导溶细胞作用的级联效应特征 建立的单一补体成分检测法 指示系统:以SRBC-抗SRBC为激活物和指示系统 参照体系:以人为设计的缺乏某种补体成分的血清为参照 结果判度:若有溶血发生,表明待检标本存在参照血清所缺 乏的补体成分,且溶血程度与此补体成分的量呈正比,仍以50 溶血为终点 参照血清常称之“R(remove)”试剂,即去除某 种补体成分之意。已能筛选到的血清有人C2缺乏、 豚鼠C4缺乏、小鼠C5缺乏和家兔C6缺乏的血清 免疫溶血法常用于C2、C3、C4、C5、C6
9、等补体 成分的检测。其中以C3、C4两成分的检测更为常见 二、免疫化学法 免疫化学法分类 1.单向免疫扩散 2.火箭免疫电泳 3.透射比浊法 4.散射比浊法 前两种方法:手工操作繁琐、耗时长、影响因素多、结果重复 性差,已趋于淘汰 后两种方法:通过仪器对补体的C3、C4、B因子等单个成分进行 自动化测定 比浊法 比浊法原理 借助补体的抗原性和与相应抗体反应的前带 现象建立的补体单个成分定量检测法。 比浊法不足 必需以过量的某种补体相应抗体为保证 自动免疫比浊法 反映所测补体成分的绝对量 可进行标准化流程管理与质量控制 第四节 补体结合试验 补体结合试验(complement fixation
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