第14章RNA转录和转录后加工.ppt
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1、,第六章、RNA转录和转录后加工,一、转录概述,转录:在DNA指导的RNA聚合酶催化下,以DNA链的一条链为模板,按照碱基配对原则合成RNA链的过程。 模板链:用于转录RNA的链称为模板链,或负()链,又称无义链。 编码链:与模板链互补的DNA链称为编码链,或正()链,又称有义链。,第一节、RNA转录,不对称转录:在DNA双链分子中,转录通常只在DNA的一条链上进行,另一条链则不能转录,但可能对转录起调节作用,这种转录方式称不对称转录。,转录起始位点,E.coli只有一种聚合酶; E.coli RNA pol全酶由5种亚基组成,即2,480kD; 2 构成核心酶,核心酶与因子构成全酶。,二、细
2、菌的RNA聚合酶及其转录,1、 E.coli RNA聚合酶,Two functional forms,4 subunits: 2 can bind to DNA can catalyze RNA synthesis but has no specificity.,5 subunits: 2 reduces the affinity of RNA polymerase for non-specific DNA and greatly increases its affinity for promoter,Core enzyme,Holoenzyme,RNA polymerase in prok.
3、,Core Enzyme,Holo Enzyme,1.1 RNA聚合酶各亚基的功能,因子:,不同原核生物具有基本相同的核心酶,但亚基有所差别,决定了原核生物基因的选择性表达。,Reusable; 修饰 RNA pol 的构型; 识别启动子,但无催化活性。,1.2 原核生物RNA聚合酶抑制剂:,利福平(Rifampin):与细菌RNA pol 亚基结合,阻碍转录的起始作用; 利链菌素( streptolydigin):与细菌RNA pol 亚基结合,抑制转录的延伸。 肝素:与细菌RNA pol 亚基结合,阻碍与模板DNA的结合。,2 细菌的启动子,启动子(Promoter): RNA聚合酶识别、
4、结合并起始转录的一段DNA序列。,共有序列(A consensus sequence): an idealized sequence in which each position represents the base most often found when many actual sequences are compared,2)、 -70 -40 :上游元件(up element) CAP-cAMP 结合位点,1)、 -35 -10:核心启动子(core promoter) RNA pol结合位点,基因表达调控的正控制位点,CAP :cAMP Acceptor Protein (cAM
5、P受体蛋白) Catabolite gene Activator Protein (分解代谢基因激活蛋白),2.1 E.coli启动子的基本元件:,1)、 核心启动子,TTGACA(Sextama Box),-35 site:RNA 聚合酶的松弛结合位点 (R site),TATAAT(pribnow Box),-10 site:RNA 聚合酶的紧密结合位点(B site),Initiation site :,+1 site。 RNA transcriptional startpoint (I site) A/G,-35 (R),-10 (B),+1 (I),RNA,间距:17bp,间距:7
6、bp,There are STRONG promoters There are WEAK promoters,The recA promoter is a strong promoter: TTGATA - 16 - TATAAT TTGACA - 17 - TATAAT,The araBAD promoter is a weak promoter: CTGACG - 18 - TACTGT TTGACA - 17 - TATAAT,up promoter mutations look more like the consenus:,down promoter mutations look l
7、ess like the consensus,Promoter efficiencies can be increased or decreased by mutation,l -10 Box与-35 Box间距17bp,有利于RNA pol启动,间距趋近于17 bp,up mutation,间距远离于17 bp,down mutation,17bp的间距比17bp的序列对转录更为重要,2)、上游元件 CAP-cAMP 结合位点 (Activator region,AR),当:ARI + CAP-cAMP, AR I: CAP-cAMP 的强结合位点(-70 -50), AR II:CAP-c
8、AMP 的弱结合位点(-50 -40),cooperative effect,提高ARII 的结合效率,RNA pol,AR II + CAP-cAMP 复合体: 促使-35 box附近GC岛区的双螺旋结构稳定性降低,-10 box的解链温度降低,有利于转录启动,RNA pol,RNA pol,-CTD,ARI ARII,Up element + CAP-cAMP RNA Polymerase复合体 CAP-cAMP 与RNA Polymerase的-CTD结合,激活转录,3.1 因子介导RNA聚合酶识别启动子,3 RNA 聚合酶怎样发现启动子?,全酶能以很高的亲和性结合在启动子;,因子的作用
9、: 降低全酶与一般DNA的非专一性结合(105,1) 增强全酶与启动子R site、B site的专一性结合(1012,数小时) 导致RNA链的延伸缓慢, factor is responsible for recognition of consensus sequence of promoter and only required for initiation.,3.2 因子的替换控制不同基因的转录,4、原核生物转录的过程,RNA的转录包括promotion,elongation,termination 转录单位(transcriptional unit ):启动子到终止子的一段DNA序列
10、原核生物中的转录单位多为多顺反子polycistron,4.1 转录的起始,RNA 聚合酶非特异性结合到DNA上并移动到启动子上,RNA 在启动子上形成闭合的二元复合物,在-10区域DNA双链打开,形成开放的二元复合物,第1、2 rNTPs 结合上来,形成第一个磷酸二酯键,第1个rNTP多为G,其次为A,很少为U, 其两侧分别为C 和T。, RNA链合成了89个碱基,三元复合物,DECISION TIME: Elongate or Abort,启动子清除,Model of the interaction between E. coil RNA polymerase holoenzyme and
11、 a promoter,DNA,Incorporating the first few Nt,4.2 转录的延伸,RNA pol沿着模板链移动,RNA链不断延伸,并保持三元复合物的结构; 转录泡中的DNA螺旋前开、后合,RNA延长,不断脱离DNA; RNA链的延伸速度不是恒定的,在模板富含GC的区域,转录就会减慢/停顿。,核心酶向前移动,RNA链不断生长。转录后的DNA区断随即恢复双链结构,RNA链被置换出来。,4.3 转录的终止,终止子(terminator):为RNA转录提供终止信号的一段DNA序列。 终止因子(termination factor ):协助RNA聚合酶识别终止子信号的辅助
12、因子(蛋白质) 转录的终止依赖于RNA产物的特定序列;,4.3.1 终止子的分类,不依赖于因子的终止子(强终止子),结构特点:RNA具有一个发夹结构(富含GC)和随后polyU片段。 作用机制:RNA pol + 发夹结构 转录暂停 后随杂合分子不稳定的poly(U-dA) RNA容易从模板上脱落RNA-DNA-RNA pol 解聚 转录终止,依赖于因子的终止子(弱终止子),结构:仍然具有茎环结构,但GC碱基对含量较少,下游也缺乏polyU结构。, factor : 275 kD 六聚体 依赖于ATP的解旋酶活性 结合新生RNA的 rut 位点,A rut site is bound by R
13、ho factor A rut site has a sequence C-rich and G- poor,1、,2、,3、,抗终止:RNA聚合酶越过终止子继续转录的现象 抗终止因子:能使RNA聚合酶越过终止子继续转录的蛋白质 抗终止是基因表达的调控事件,4.3.2 抗终止(antitermination),抗终止需要Nut位点,When pN recognizes the nut site, it act on RNA pol to ensure that the enzyme can no longer respond to the terminator.,NusA protein:,
14、69 kD, RNA pol-attaching factor, Impel RNA pol. pausing in terminator and waiting for Rho factor to stop transcription of RNA,antitermination N protein utilization substance,The Nus factors. NusA is required for intrinsic terminators, NusA and NusB-S10 is required for rho-dependent terminators.,pN:,
15、NusA binds to polymerase, and N binds to both NusA and box B of the nut site region of the transcript, creating a loop in the growing RNA. This complex is relatively weak and can cause antitermination only at terminators near the nut site (These conditions exist only in vitro.).,S10 binds to polymer
16、ase, and NusB binds to box A of the nut site region of the transcript. This provides an additional link between the polymerase and the transcript, strengthening the complex. NusG also contributes to the strength of the complex. This complex is processive and can cause anti-termination thousands of b
17、ase pairs downstream in vivo (open arrow).,三、真核生物的转录,、真核生物的RNA聚合酶,线粒体和叶绿体也有各自的RNA聚合酶,结构简单,类似于细菌RNA聚合酶,能催化所有种类RNA的合成。,RNApol. I, II, III,L with 78%homologous between 3 RNApol. I, II, III,L of prokaryote RNApol. L of prokaryote RNApol. (功能相似),RNApol II (B); -For pre-mRNA transcription -Located in nucl
18、eoplasm -L maximum subunit 240 kd 7aa repeats & high frequency phosphorylation TyrSerPProThrPSerPProSerP,Yeast 26X Drosophila 44X repeat unit of 7 aa / in CTD Rat & Human 52X,-依CTD中,Ser, Thr 磷酸化与否,将L 分为3个Subforms,IIO (240kd) IIA (220kd) IIB (180kd),高度磷酸化 CTD over-phosphorylated,提高转录效率10X IIA,蛋白酶水解 N
19、on-physiological form,基本结合型 Initially binds to promoter,RNA 聚合酶的亚基组成,每种RNA聚合酶含有12个或更多个不同的亚基; 三种RNA聚合酶最大的两个亚基彼此相似,且与E.coli RNA pol 的, 相似.; 至少5种亚基在三种RNA聚合酶中是共同的; 每种RNA聚合酶有4-7种特有的亚基.,真核RNA聚合酶同原核RNA聚合酶异同,不需要引物 从5 3合成RNA. RNA产物与反义模板链互补.,不同,真核细胞核内有3种RNA聚合酶; 需要转录因子结合到启动子起始转录; RNA聚合酶II最大亚基有羧基末端结构域(CTD ),且CT
20、D的磷酸化是转录延伸所必需的; CTD是转录延伸过程中特异激活的一个重要标靶,2 真核生物的启动子,2.1 I 型启动子:,upstream regulator elements,core promoter:31 6, URE:180 107,提高转录效率,UBF(Upstream binding factor):与启动子核心结构及URE相互作用; SL1(Selectivity factor1 ):扩大UBF的作用区域,促进其与启动子核心序列的结合;,Transcript factors,TBP(TATA-binding protein, TATA结合蛋白) 1个, 确保RNA聚合酶I定位于
21、转录起始位点。 TAF(TBP-associated factors, TBP 相关因子) 3个,.,UBF+URE UBF+Part of core promoter Two UBF interaction causing DNA to form a loop,Allows RNA pol binding complex to initiate,2.2 II 型启动子,基本启动子(basal promoter):TATA框 起始子(initiator):PyPyAN PyPy。 上游元件(upstream element): CAAT框,GC框,八聚体框 应答元件(response elem
22、ent),2.2.1 II型启动子的组成,真核生物RNA pol不具有全能性,需要严格依赖于一系列蛋白因子才能识别和结合到启动子特定序列上,并启动转录反应。 真核基因转录必需的辅助蛋白统称为“转录因子” ,其作用或识别DNA的顺式元件、或识别RNA聚合酶、或识别其它因子。其作用或识别DNA的顺式元件、或识别RNA聚合酶、或识别其它因子,2.2.2 转录因子,通用因子General transcript factor(GTF) 上游因子Upstream factor 可诱导因子Induce factor,RNA聚合酶II 的转录因子有3种:,2.2.3 II 型启动子起始转录,前转录起始复合物(
23、Forming pre-TIC) 基本转录起始复合物(Forming basic-TIC ) 完整转录起始复合物(Forming complete-TIC ) 起始转录(The initiation)。,TIC:Transcriptional Initiation Complex,TATA框是RNA聚合酶和通用转录因子形成前起始复合物的主要装配点。,(1)TFIID: A sort of protein complex (TBP&8TAF),(TBP): 三种RNApols所需。 羧基末端有180个非常保守的氨基酸。 结合到DNA的小沟并使其弯曲。 决定转录起始位点 控制基本转录上游元件的效率
24、。,Wilds minor groove,pre-TIC,(2)TFIIA:结合到TFII D , 增强TFII D与TATA框的结合,稳定DNA-TFII D 复合物,Transcriptional Initiation Complex,Basic TIC,(3)TFIIB:结合到TFIID 和 RNA pol II,作为一个桥梁因子允许RNA pol II 和TFIIF结合到复合物,(4)TFIIF:包括RAP38和RAP74两个亚基,通过其解螺旋酶活性使RNA合成进入延伸阶段,(5)TFIIH: 一个蛋白复合体5亚基, 含有解旋酶活性和激酶活性(使CTD 磷酸化),(6)TFIIE: A
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