第三章DNA多态性分析基础.ppt
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1、第 三 章 DNA多态性分析基础,人类DNA遗传标记-法医物证学应用研究的热点 由常量检材到微量检材 -微量检材的检验 由蛋白质水平到DNA水平 -陈旧检材的检验、取材的广泛性 实现了仅能否定到高概率肯定 -提高了法庭证据的可靠性 人类DNA遗传标记-特定的座位上出现等位基因 出现在编码区或非编码区 表现为序列多态性或长度多态性,第一节 DNA分子结构与功能 一、DNA的分子结构 DNA是由4种核苷酸通过磷酸二酯键连接成的线性多聚体 1.DNA的基本结构单位 碱 基 A G C T 核 苷 核苷酸,脱氧核苷酸=碱基+脱氧核糖+磷酸,dNTP dNDP dNMP,2.DNA的分子结构 一级结构-
2、DNA分子中核苷酸的排列顺序 链接方式 3,5磷酸二酯键连接 戊糖和磷酸构成多聚核苷酸对骨架 含氮碱基突出于骨架上 不对称末端 5-自由的磷酸,3-游离的羟基 生物学意义 1. 遗传信息的载体 2. 构成DNA遗传标记的结构基础,二级结构-两条DNA单链形成的双螺旋结构 双螺旋结构的特征 1. 两条单链逆向平行排列, 绕同一中心轴形成双螺旋 2. 两条单链间以氢键连接 碱基互补原则:A=T,C=G * 稳定性与G+C含量呈正比 * 嘌呤和嘧啶相等: A+G=C+T 配对原则的意义 1.复制的分子学基础 遗传信息传给子代 2.转录的分子学基础 RNA合成的模板 蛋白质 3.DNA多态性分析的分子
3、学基础 DNA遗传多态性,三级结构-超级螺旋结构 结构特征 真核生物DNA三级结构-核小体 140bpDNA双链缠绕组蛋白8聚体 60bp的连接链(结合有组蛋白H1) 生物学意义 压缩DNA分子体积,有利于在细胞 中包装组蛋白对DNA分子完整性的 保护作用 统计数据 人类基因组DNA直线长2m 细胞核直径5um DNA分子被压缩了近一万倍,二、DNA的理化性质 DNA是生物大分子,因此具有高分子物质的一般性质 粘 性 较大 溶液的粘性与溶质分子的不对称性有关 两性电解质 DNA含有磷酸基团(-)和含氮碱基(+) 等电点低-中性或弱碱性溶液-带负电 电泳技术进行分离的分子基础 可以与金属离子(N
4、a,K,Mg.Mn)结合成盐 DNA+盐(乙醇或异丙醇)DNA沉淀析出 可以和组氨酸结合 使DNA分子更具有稳定性 吸收紫外线 碱基含有共轭双链 ( 最大吸收波长260nm ) 对DNA样品进行定量分析,1.DNA的变性 概念:在加热、溶液碱性、有机溶剂、二甲基亜砜、甲酰胺等条件 下,DNA双链间的氢键断裂,形成两条单链DNA分子的过程。 变化:溶液粘度降低,沉降速率增加,浮力密度上升,紫外线吸收增强 增色效应随温度上升,DNA溶液的紫外线吸收增强,A260nm值 DNA对紫外线吸收强度与变性程度成正比 OD260值:双链DNA 单链DNA 单核苷酸 融链温度随温度上升,一半DNA分子变性时的
5、温度 (Tm值) Tm值与DNA分子中G/C含量呈线性关系 估计DNA的GC含量 ( G+C)% = (Tm69.3) 2.44 估算引物的Tm 值 Tm = 4 ( G + C ) + 2 ( A + T ) Tm值受介质中离子强度的影响 在高离子强度溶液中相对稳定(1mol/L NaCl) 某些因素影响下DNA分子共价键断裂小片段DNA的过程:DNA降解,2.DNA的复性 概念:当撤除变性因素后,原变性的两条互补DNA单链通过基配对又重 新缔合成为双链结构的过程叫复性。 * 加热后变性的DNA在温度降低过程中的复性有称为退火 影响:温度影响最适为Tm以下25,过高不易复性;过低碱基错配 离
6、子强度足够盐浓度中和DNA分子携带负电荷利于复性 分子结构简单序列的、小分子DNA-易发现互补序列-复性快 溶液浓度高浓度DNA溶液较低浓度DNA溶液易复性 * 影响复性过程的主要因素:复性温度与溶液的离子强度 杂交:在复性的条件下,来源不同、但具有碱基互补的DNA单链按碱基 配对原则形成双链DNA分子的过程称作杂交。 * 局部碱基序列具有同源性的DNA分子也能形成局部杂交产物 杂交技术:在复性条件下,探针与靶DNA单链形成杂交双链 用以分析两核酸分子间的碱基互补程度 探 针:标记有失踪物的寡核苷酸片段,三、DNA的复制和基因表达 1.DNA的复制 概念:复制是指以原来的DNA为模 板合成相同
7、DNA分子的过程 复制的基础-碱基互补原 方式: 半保留复制 半不连续 过程:复制的起始 双链解开 引物合成 DNA链延伸 5-3方向 DNA聚合酶 复制的终止 引物切除 缺口连接,DNA聚合酶-催化脱氧核苷三磷酸聚合成DNA链的酶 条 件:必须有引物、复制模板、合成DNA的原料dNTP及微量Mg2+ 作 用:具有合成、切除和校对的综合功能 大肠杆菌DNA聚合酶IpolA基因编码的多功能酶 68kd C端2/3 5-3 聚合酶活性合成 103kd N端1/3 3-5 外切酶活性校对作用 35kd 5-3 外切酶活性切除 真核生物DNA聚合酶四种酶都具有5-3方向聚合作用 参与核 DNA的合成(
8、链合成的引发) 具有外切酶的活性(修复、校对) 线粒体 DNA的复制 参与核 DNA的合成(链的延长及其他) 忠实性:是保证生物信息准确传递的必要条件 机制 专一性识别碱基-合成控制:碱基对、酶、引物 3-5外切酸活性-校对控制:,2.基因表达 概念:将储存于DNA中的遗传信息转变成RNA和蛋白质分子,通过这 些蛋白质分子的功能活动使声明体表现各种各样的生理功能 和千差万别的生物性状。 阶段:转录DNA分子作为模板直接指导RNA分子的合成过程 翻译RNA分子上的核苷酸序列信息转变成蛋白质中氨基酸,四、DNA的损伤与修复 1.DNA损伤-是指DNA双螺旋结构出现的任何改变 体内 复制错误 DNA
9、复制错配率10-1,10-2 自发损伤 碱基脱嘌呤A或G被切下来导致突变 碱基脱氨基C 脱氨成为 UU与A配对 外界 物理因素 紫 外 线 嘧啶间诱导形成共价键嘧啶二聚体(TT) 嘌呤间形成异常化学键 电离辐射 机理构成基因的化学物质电离 结果碱基破坏、核糖分解、DNA分子断裂 化学因素 烷 化 剂 烷基置换碱基的氢原子 -碱基被烷化,造成基因改变 类 似 物 替代正常碱基掺入DNA链中引起错配 5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤,2.DNA修复 切除修复恢复正常结构 重组修复-损伤可以保留,第二节 人 类 基 因 组 基因组概念 广义概念:一个生物体的所有基因或遗传物质 狭义概念:一大组基因、一个染
10、色体或几个染色体的基因 * 基因组包含基因序列(20-30%) + 非基因序列(70-80%) 基因组构成 核 基 因 组:单倍体细胞内的全部DNA分子,3109 bp 体细胞22对常染色体和1对性染色体 性细胞22条常染色体和1条型染色体 * 每个细胞含相同的基因组拷贝(特殊除外) * 平均每个细胞含有610pg的DNA 线粒体基因组:线粒体内包含的全部DNA分子,16569bp * 每个细胞平均有800个线粒体 * 每个线粒体含有10个DNA拷贝,一、人类核基因组DNA 1.基因与基因有关序列 基因组成:包括合成有功能的多肽链或RNA所必需的全部序列,真核生物-断裂基因 基因中编码序列被若
11、干个插入序列分隔的不连续的镶嵌结构 编码序列-外显子( n ) 10%50% 插入序列-内含子(n-1) 50%90% 决定基因长度 编 码 率-编码序列长度占整个基因序列的比例 外显子 内含子 转录:模板DNA 初级RNA 成熟RNA 剪接方式:特定外显子+不同外显子-表达多种产物 表现为外显子/或 内含子-表现多种功能 由同一DNA序列可以得到不同的mRNA,从而编码多种 具有部分重叠序列的蛋白质的基因称为重叠基因,GT AG GT AG,基因分类 结构基因:合成结构蛋白、催化生化反应的酶 调节基因:阻遏蛋白或激活蛋白,控制基因活性 既可以转录成RNA,又可以翻译成蛋白质 rRNA基因:产
12、物是核糖体的核糖体RNA tRNA基因:产物是转移RNA 只转录产生相应RNA,而不翻译成蛋白质 相关序列 前导序列和尾随序列-能被转录,但不被翻译 启 动 子:RNA聚合酶与DNA结合起始部位 位置:基因转录起点上游(5-1kb) 作用:能与RNA酶结合,调控基因表达 增 强 子:调节基因产物与DNA结合的部位 位置:基因上游,促进基因转录活性 作用:促进转录活性,增强启动子 2.基因外DNA 功能不清,多拷贝或低拷贝形式;30%串联重复,3.重复序列 概念:在基因组中反复出现,在基因组中含有一个以上相同 顺序拷贝的DNA序列称为重复序列-DNA多态性基础 分类:反向重复序列-两个序列相同的
13、拷贝在DNA上呈反向排列 重复序列间有间隔 位于基因调控区内 重复序列间无间隔 与基因的转录、复制有关 串联重复序列-相对恒定的序列为重复单位,首尾相接 大卫星DNA(macrosatellite DNA) 主要在在非编码区 小卫星DNA ( minisatellite DNA ) 与染色体折叠压缩 微卫星DNA (microsatellite DNA) 和染色体配对有关 散在重复序列-相同序列的重复单位散在分布 短散布元件 500bp Alu序列 序列长平均250bp,含有Alu I酶切位点(AGCT) 同源性高达80%,但具有种属特异性 人类Alu序列长300bp(130bp+31bp+1
14、30bp) 长散布元件 6-7kb Kpn序列 约6500bp,卫星DNA,发现:DNA主带以外有多个小的卫星带 分类:大卫星-根据浮力密度不同 1.687 卫星DNA(25-48bp) 1.693 卫星DNA(5bp-ATTCC-) 1.697 卫星DNA(5bp-ATTCC-) 1.700 卫星DNA(隐蔽的卫星DNA) 卫星DNA 171bp 灵长类特有 卫星DNA 68bp 富含GC 卫星DNA 220bp 成分:GC含量少于主带中的DNA 特征:DNA呈串联重复形式 各类型家族成员序列G/C含量近似 具有相同的浮力密度 但是重复序列特征有明显差异,所有串联重复DNA序列都称为-卫星D
15、NA 根据重复序列长度和序列特征分类 小卫星DNA 微卫星DNA ( minisatellite DNA ) (microsatellite DNA) 重复单位 15bp-30bp 2bp-6bp 重复次数 数次至数百次 10bp-60次 序列总长 100bp-20kd 300bp 序列特征 核心序列 单拷贝 多态原因 VNTR STR 形成机制 不等交换,重组 复制滑动 主要分布 近端粒处,着丝点 内含子、间隔DNA 有特定的基因座定位 有特定的基因座定位 核心序列-富含G/C或A/T的保守序列 不同小卫星高度同源性-DNA指纹技术,4.假 基 因:与正常功能基因在核苷酸序列上相似,但不能转
16、录或 转录后生成无功能基因产物的DNA序列。 突变:复制-失去调控;转录-拼接信号;翻译-终止信号 其他:丢失5或3端部分而失去活性基因片段 5.基因家族:基因组中来源相同,结构相似,功能相关的一组基因 产物:编码 R N A snRNA, tRNA, rRNA 编码蛋白质 组蛋白、珠蛋白、生长激素 位置:同一个染色体上或不同染色体上 分类:多 基 因 家 族(rRNA基因家族) 散在基因家族(珠蛋白基因家族) 超 基 因 家 族(免疫球蛋白、组织相容性复合体) 6.转位因子:DNA分子内部或分子间可以移动的DNA片段 特点:保留原位的序列,新合成复本的插入,可以遗传 部位:不固定(内含子、基
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