拟南芥T-DNA插入突变.ppt
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1、拟南芥TDNA 插入 突变体的鉴定 1、反向遗传学 经典遗传学:由表及里,即通过杂交等手段观察表型性 状的变化而推知遗传基因的存在与变化。 表型基因 反向遗传学:由里及表,即通过DNA重组等技术有目 的地、精确定位地改造改造基因的精细结构以确定这 些变化对表型性状的直接影响。 基因表型 研究基因功能的方法 1、转基因技术 2、基因敲除 3、基因敲入 4、基因诱导超表达 5、基因诱捕技术 6、 RNAi干扰 7、生物信息学分析 8、反义技术 1、反向遗传学 2、反向遗传学的重要手段T-DNA插入突变技术 T-DNA插入突变技术,通过插入已知序列的T-DNA,破坏 目标基因的结构使之沉默;将目的基
2、因插入到Ti质粒的T- DNA上,通过农杆菌的转化作用,将目的基因整合到植物细 胞染色体DNA上,使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表 达 农杆菌是一种在土壤中生活的微生物,能在自然条件下感染 双子叶植物和裸子植物,而对大多数单子叶植物没有感 染能力。 根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti(Tumour inducing)质粒和Ri质粒,其上有一段T-DNA(Transferring DNA) ,它能稳定地整合到植物基因组中并稳定地表达。 Ti质粒 已成为植物分子生物学中广泛应用的遗传转化载体,而外基 因就是整合到T-DNA上的。 农杆菌质粒 2、反向遗传学的重要手段T-DNA插入突变技
3、术 During tumour induction, Agrobacterium attaches onto plant cells and then transfers part of its DNA to some of these cells. The transferred DNA (T-DNA) which is found on a large Ti (tumour inducing) plasmid ,is modified within the bacterium and is transferred to the plant where it becomes integrat
4、ed into the plant genome. the mechanism of T-DNA insertion Proteins which are encoded by the virulence (vir) region of the Ti plasmid regulate the T-DNA modification and transfer. Phenolic compounds that are derived from a wounded plant cell induce expression of the vir region genes. Virulence prote
5、ins recognise the border sequences (LB、RB)that define the T-DNA. In the presence of VirD1 protein, VirD2 cleaves the border sequence. A single-stranded T-DNA is produced when the nicked DNA is released from the plasmid. 2、反向遗传学的重要手段T-DNA插入突变技术 the mechanism of T-DNA insertion 2、反向遗传学的重要手段T-DNA插入突变技术
6、 In the plant cell, the T-DNA is coated with the single-stranded DNA-binding protein, VirE2. The complex that comprises of the T-DNA bound to the binding protein then moves into the nucleus and is integrated into the nuclear genome. the mechanism of T-DNA insertion 2、反向遗传学的重要手段T-DNA插入突变技术 转 化 过 程 示
7、意 图 2、反向遗传学的重要手段T-DNA插入突变技术 来源:arabidopsis.info/students/paaras/t_dna.htm 3、反向遗传学方法研究赤霉素糖苷转移酶基因 (1)研究背景 (2)模式生物拟南芥 (3)筛选纯合突变体 (4)表型鉴定 (1)研究背景 赤霉素可促进叶和芽的生长,用于农业生 产,在某些方面有较好的效果。赤霉素的 生物合成和代谢对赤霉素活性的调控作用 已了解的比较清楚。 植物界广泛存在的赤霉素糖基化修饰对赤 霉素活性的作用,以及糖基化修饰能否调 控以及如何调控赤霉素的活性并进而影响 植物的生长发育的问题尚未解决。 拟南芥是一种十字花科植物,广泛用于植
8、物遗传学、发育 生物学和分子生物学的研究,已成为一种典型的模式植物 。 植物特点: (1) 生长周期短, 6周内完成; (2) 基因组小, 仅有5 条染色体,113 亿个碱基对,但是它的大多数基因与 其他“复杂”的植物基因具有很高的同源性, (3) 具有双子叶植物的所有特性 (4) 有效的农杆菌介导转化途径,易获得大量的突变体和基因组资源; (5) 在有限的空间内可大量种植,体形小, 占地少 (6) 收获大量的种子,每株拟南芥可产生多达5000 粒种子; (7) 生活力强,用普通培养基就可作人工培养。 (2)模式生物拟南芥 Arabidopsis thaliana 目前已经完成测序的植物有三种
9、:拟南芥 、水稻、毛果杨(Populus trichocarpa)。 美国NCBI下面的植物基因组数据库资料: http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/PLAN TS/PlantList.html 拟南芥的基因敲除文库的建立 实验方案设计 1.确定所要研究的基因 通过生物信息学的方法推测出一些可能具 有赤霉素糖基转移酶的基因。 2.获得种子 进入如下网站http:/arabidopsis.org/index.jsp,输入 种子基因型号。 (3)筛选纯和突变体 1、实验方案设计 (3)筛选纯合突变体 点击进入基因序列信息网页 实验方案设计 (3)筛选纯和突变体 实验
10、方案设计 (3)筛选纯合突变体 输入种子基因型号 实验方案设计 (3)筛选纯合突变体 点击进入基因序列网页 实验方案设计 (3)筛选纯合突变体 基因序列网页 实验方案设计 (3)筛选纯合突变体 查找突变体及引物设计 实验方案设计 (3)筛选纯合突变体 输入基因型号 实验方案设计 (3)筛选纯合突变体 查看含有相关基因的种子信息 实验方案设计 (3)筛选纯合突变体 引物设计 实验方案设计 (3)筛选纯合突变体 中间引物的设计 实验方案设计 (3)筛选纯合突变体 两侧引物的设计 实验方案设计 (3)筛选纯合突变体 2、实验材料 赤霉素糖基转移酶基因的T-DNA插入突变种子: SALK_064481
11、.43.20.x LP(左引物): GCTGGAGTCCACAACTTGAAG Len 21 TM 59.90 GC 52.38 RP(右引物): AACTCCTCCTCAAAGGCTCAG Len 21 TM 60.00 GC 52.38 器材:离心机,离心管,PCR仪,点泳池,电泳现 象仪 (3)筛选纯合突变体 实验原理 (3)筛选纯和突变体 三引物法 3、突变体鉴定原理 (3)筛选纯和突变体 “三引物法”即采用三个引物(LP、RP、LB)进行PCR扩增。 野生型植株(WT)目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA 插入,所以其PCR产物仅有1种,片段大小为基因的长度(即 从LP到RP的长
12、度) 纯合突变体植株(HM)目的基因的两条染色体上均发生T- DNA插入,而T-DNA本身的长度约为17 kb,过长的模板会阻 抑目的基因特异扩增产物的形成,所以也只能得到1种以LB 与RP(或LP,根据T-DNA在基因上插入的方向选择)为引物 进行扩增的产物,分子量约410+N bp(即从LP或RP到T-DNA 插入位点的片段,长度为300+N bp,再加上从LB到T-DNA载 体左边界的片段,长度为110bp); 杂合突变体植株(HZ)只在目的基因的一条染色体上发生了 T-DNA插入,所以PCR扩增后可同时得到410+N bp和片段大小 为基因的长度bp两种产物。电泳结果差异明显,能有效区
13、分 不同基因型的植株。 双引物法 与“三引物法” 本质相同。 实验原理 (3)筛选纯和突变体 首先以基因组 D N A作为模板,用一对特异引物(LP和RP)扩增 目的基因片段,野生型和突变杂合体均一条带,纯合突变体 没有条带;然后再以基因组DNA 为模板,由T-DNA 片段的特异 引物(LB)与LP 或RP 组成一对引物,扩增目的基因T-DNA 插入 片,野生型没有条带,杂合体和纯合体一条410+N。 不足之处是完成最终鉴定需进行两轮P C R 扩增。 4.3 电泳并观察结果 配制琼脂糖凝胶,将扩增后的样品加入凝胶 孔电泳,电泳后观察结果。 5.结果分析 使用三引物法PCR检测,若电泳图上出现
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