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1、第八节 常用定量分析方法 三、薄层扫描法 薄层扫描法是以薄层色谱法为基础发展起来 的薄层色谱组分原位分析方法及薄层色谱的记录 方法,又称薄层色谱扫描法(TLCS),相应仪 器称为薄层扫描仪(Thin Layer Chromatogram Scanner)。 薄层扫描法是用一定波长的光照射在薄层板 上,对薄层色谱中吸收紫外光或可见光的斑点, 或经激发后能发射出荧光的斑点进行扫描,将扫 描得到的图谱及积分数据用于药品的鉴别、杂质 检查或含量测定。 (一)基本原理 薄层扫描法是指薄层色谱斑点的色谱扫 描,薄层色谱扫描是指固定波长,斑点移动 ,测定A-l或F-l曲线。根据薄层扫描的测定 方式分为薄层吸
2、收扫描法和薄层荧光扫描法 二种方法。 1、薄层吸收扫描法 基本原理:Kubelka-Munk理论及曲线。由于薄层板存在 明显的散射现象,斑点中物质的浓度与吸光度的关系需用 Kubelka-Munk理论及曲线来描述。Kubelka-Munk理论以斑点 的相对反射率和相对透光率计算薄层色谱斑点的吸光度,说 明了固定相的散射参数SX对斑点中物质的浓度与吸光度间关 系的影响,获得不同散射参数SX时斑点的A-KX理论曲线,即 Kubelka-Munk曲线。 光源:钨灯和氘灯; 灵敏度:在200-800nm波长范围内选择合适波长进行测定 ,其灵敏度可达ng级; 适用范围:适用于在可见、紫外区有吸收的物质,
3、及通 过色谱前或色谱后衍生成上述化合物的样品组分。 2、薄层荧光扫描法 基本原理:F=2.3KI。ECL或F=KC 光源:氙灯或汞灯。 灵敏度:最低可测到10-50pg。 适用范围:适合于本身具有荧光或经过适当处理 后可产生荧光的物质的测定。 Kubelka-Munk理论不适用于薄层荧光扫描,无需 进行曲线校直。用薄层荧光扫描进行定量分析时,用 斑点荧光强度的积分值(色谱峰峰面积)与斑点中组 分的含量代替上式中F与C 进行运算。 (二)薄层色谱的规范化操作 1、仪器与材料 薄层板;涂布器;点样器材;展开箱 (层析缸)显色与检测仪器 2、操作方法 薄层板的制备;点样;展开;检测; (三)定量分析
4、方法 1、方法学考察 新建薄层扫描定量方法必须进行方 法考察,以说明新建方法的可靠性,考 察的内容有工作曲线、定量结果的精密 度及准确度、统计检验等内容。 (1)工作曲线 检查所选择的散射参数SX值是否适宜。SX值适宜则工 作曲线被校直为直线,否则,调整SX值再校正,直至在一定 点样量范围内工作曲线成直线为止。 考察工作曲线是否过原点,以便确定采用一点法或二 点法定量。 确定点样量的线性范围。既使采用曲线校直,也只是 在一定点样量范围内工作曲线为直线,因此需确定点样量的 上、下限。 为降低定量误差,最好调整点样量,使供试品与对照品 的峰面积相接近。 为了克服薄层板间差异,外标法及内标法均应采用
5、随行 标准法,即标准溶液与供试品溶液交叉点在同一块薄层板上 。 (2)精密度考察 取同一供试品溶液,在同一块薄层板上以 相同点样量平行点5点以上,展开后测定其峰 面积,求算相对标准差(RSD),作为衡量定 量分析结果精密度的指标。RSD应小于4%。 式中:为n次测量的平均值,S为标准差。 (3)准确度考察 回收率是衡量定量方法准确度的指标,常用 加样回收率(R)来衡量,其值应在95-105%之间 ,测量数据一般为5-6个。 将加入纯品的试样溶液、供试品溶液及标准 溶液点于同一块薄层板上,展开后进行薄层扫描 ,测定各斑点的峰面积,计算各溶液中组分的量 ,计算回收率(R)。 (4)统计检验 统计检
6、验是检验两种方法、两台仪器或两个人测量 的两组实验数据的精密度或准确度(偶然误差或系统误 差)间是否存在显著性差异,说明新建定量方法可否代 替旧方法或优于旧方法。 统计检验包括F检验与t检验。 F检验即精密度差别检验,用以检验两组数据的精 密度或偶然误差是否存在显著性差异,一般为单侧检验 。 t检验即准确度差别检验,用以检验两组测量数据 的平均值或系统误差是否存在显著性差异。若t检验证 明两种方法测得的均值不存在显著性差异时,则新方法 可以代替旧方法,t检验一般为双侧检验。 t检验与F检验的具体方法参见分析化学的有关论著 ,此从略。 2、定量方法 常用的定量方法有外标法、内标法、追加法(叠 加
7、法)及回归曲线定量法。 (1)外标法 外标法是薄层色谱扫描最常用的定量方法,方法 简便,但点样必须准确。 外标一点法 工作曲线通过原点(截距为零)时可用外标一点 法定量。只需点一种浓度的标准品溶液,与供试液同 板展开,对比,测定组分含量,其计算公式为: C=F1A 式中:C为组分的重量或浓度,A为测得该组分的 峰面积,F1为直线的斜率或比例常数。 外标二点法 工作曲线不通过原点时,只能用外标二点法定量, 至少需点二种不同浓度的标准溶液(或一种浓度两种点 样量),才能决定一直线,其计算公式为: C=F1A+F2 式中:C、A同前,F1为直线的斜率或比例常数,F2 为纵坐标的截距,F1和F2值由仪
8、器自动算出。 外标一点法、二点法只是指用一种或二种浓度的标准溶液对比 定量,为减小误差,同一薄板上供试品点样不得少于4个,对照品 每一浓度不得少于2个;并调整标淮溶液的浓度或供试品与标准溶 液的点样量,使其峰面积相接近;且点样量必须准确,宜用定量毛 细管点样。 (2)内标法 内标法是选一个纯物质作为内标物,并准确称 取一定量内标物加至供试液及标准液中,计算供试 品溶液中某组分含量的定量方法。 内标物的选择要求是: Z 纯度合乎要求,展开后不得有杂质斑点,否则内 标斑点的峰面积将不能代表内标物的量。 Z 内标物须为样品中所不含有的成分。 Z 内标物不与其它斑点相重叠,分离度合乎要求。 Z 为简化
9、计算,内标物在标准溶液及供试品溶液中 的浓度应相等。 特点: 1)在一定点样量范围内,内标法定量准确度与点样量无关 。 2)不易找到适宜Rf值的纯品内标物,且溶液配制等操作较 麻烦。 方法: 1)内标一点法:当工作曲线通过原点时采用内标一点法。 内标一点法公式: 2)工作曲线不通过原点时必须采用内标二点法 内标二点法公式: 式中:C、Cis分别为组分及内标物的浓度或重量,A、Ais分 别为测得组分及内标物的峰面积,F1为直线的斜率或比例常数, F2为截距,F1和F2由仪器自动计算并内存,可直接给出样品的浓 度或重量。 (3)回归曲线定量法 将不同浓度(或不同量)的标准溶液与供 试液点在同一块薄
10、层板上,展开、扫描; 由计算机对所测得的峰面积及相应点样量 进行线性或非线性回归; 直接由回归方程或回归曲线计算供试液含 量的方法; CAMAG系列薄层扫描仪即采用此方法。 (四)影响薄层色谱分析的主要因素 1、样品的预处理及供试液的制备 2、薄层色谱的点样技术 3、吸附剂的活性与相对湿度的影响 4、溶剂蒸气在薄层色谱中的作用 5、温度的影响 第九节 含量测定方法的效能指标 任何一种分析方法,根据其使用对象和 要求,都应有相应的效能指标。常用的效能 评价指标有:准确度、精密度、选择性、检 测限、定量限、线性与范围、耐用性等。 分析方法的效能指标可以作为对分析方 法的评估尺度,也可作为建立新的分
11、析方法 的实验研究依据。 一、准确度 准确度是指测定结果与真实值或参 考值接近的程度,表示分析方法测量 的正确性,一般以回收率(%)表示。 准确度应在规定的范围内建立。 即于已知被测物含量(A)的试样中加入一定量(B)的被测物 对照品进行测定,得总量(C)。 回收率(%)=(C-A)/B100% 在规定范围内(即A+B在标准曲线的线性范围内,且控制A:B在 1:1左右),测定次数n5,报告平均回收率(%)和RSD. 中药制剂含量测定的回收率一般要求在95%105%,一些方法操作步 骤繁复,可要求略低不可小于90%。RSD一般应在3%以内。 而生物样品分析时,一般控制回收率应在85%115%(样
12、品药浓 200g/L)及80%120%(样品药浓200g/L),RSD争取达到5% 以内,但不超过10%。 标准偏差(S)和相对标准偏差(RSD)的计算公式分别为: S= 和RSD(%)= 式中n为测定次数,Xi 为各测定值,X为n次测定的平均值 二、精密度 精密度系指用该法经多次取样测定同一个均匀样品 ,各测定值彼此接近的程度。精密度一般用标准偏差( S)或相对标准偏差(RSD)表示,或同时报告可信限。 在相同条件下,由一个分析人员同一次测定所得结 果的精密度称为重复性; 在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度, 称为重现性。考察的变动因素包括不同实验室,不同分 析人员,不同仪器,不批号
13、试剂,不同测试耗用时间, 不同环境(分析温度、湿度等)、不同测定日期等。当 分析方法将被法定标准采用时,应进行重现性试验。 测定方法:HPLC方法的精密度测试,应从样品 开始,设计3个浓度,分别平行制备3份,以测 定含量计算相对标准偏差;或同一样品平行制 备6份供试品,分别进样,以封面积极拴相对标 准偏差。 1重复性(n9,33) 2中间精密度 3重现性 三、专属性 定义:在其它成分可能存在下,方法能正 常测定出被测物的特性。 1鉴别反应 测定 2含量测定: 空白制剂,模拟复方 杂质测定: 加速破坏试样测验 限量检查: DAD,MSD进行峰纯 度检查 四、线性与范围 分析方法的线性是指在设计的
14、范围内,测试结果与试样中 被测物浓度成正比关系的程度。换言之,就是试样中被测物浓度 的变化与试验结果(或测得的响应信号)成线性关系。 所谓线性范围是指能达到一定精密度,准确度和线性,测 试方法适用的高、低限浓度或量的区间。 线性与范围可通过绘制标准曲线来确定。 通常是在一定条件下,分别精密制备至少5个不同浓度的供 试样品(或对照品)进行测定,用作图法(响应信号或经数学转 换的响应信号(Y)对被测物浓度或量(X)作图)或计算回归方 程(Y=a+bX)得标准曲线。 用相关系数(r)来衡量标准曲线的 线性度,并控制r0.999,但薄层色谱扫描定量中r 0.995即 可。 线性:在设计范围内,测试结果
15、与供试品 中被测物浓度直接呈正比关系的程度。 范围:在能达到一定精密度、准确度和线 性,测试方法适用的高低浓度或量的区间 。 测定:至少5个浓度(n5),每个浓度进 样3次,以3次进样的平均峰面积对样品浓 度进行线性回归。 五、检测限和定量限 检测限(LOD):供试品中被测物能被检测出的最 低量。 通常采用信噪比3:1或2:1 定量限(LOQ):供试品中被测物能被定量测定的 最低量。 通常采用信噪比10:1 S/N = hp/hbaselinenoise 测定:将一对照品储备溶液,逐步稀释,分别进样 分析,计算相应色谱峰高hp和平均基线噪音( hbaselinenoise)之比。通常报告进样体
16、积(须与 样品制备方法相关) (动画) 五、耐用性 耐用性是指在测定条件有小的变动时,测定结果 不受影响的承受程度,为常规检验提供依据。开始研 究分析方法时,就应考虑其耐用性。如果测试条件要 求苛刻,则应在方法中写明。 典型的变动因素有:被测溶液的稳定性,样品提 取次数,时间等。 液相色谱法典型的变动因素有:流动相的组成和pH值,不 同厂牌或不同批号的同类型色谱柱,柱温、流速等。 气相色谱法的变动因素有:不同厂牌或批号的色谱柱、固定 相、不同类型的担体、柱温、进样口和检测器温度等。 薄层色谱法的变动因素有:吸附剂或薄层板的型号和厂牌, 展开时的温度、湿度等。 检验项目和验证内容 鉴别鉴别 杂质
17、测杂质测 定(定量/限度 ) 含量测测定及溶出量测测 定 准确度 -+-+ 重复性 -+-+ 中间间精密度 -+-+ 专专属性 +- 检测检测 限 -+- 定量限 -+-+ 线线性和范围围 -+-+ 耐用性 + 第四章 中药制剂的鉴别 1、概念: 中药制剂的鉴别 是利用一定的方法来确定中药制剂中 原料药的组成,从而判断该制剂的真伪。 中药制剂鉴别主要内容 包括性状鉴别、显微鉴别、 理化鉴别等方面,有时在性状鉴别中还应作相应物理常数 的测定。 本章重点论述显微鉴别和理化鉴别。 第一节 性状鉴别 中药制剂的性状是指除去包装后的 性状。 中药制剂性状鉴别包括大小、色泽 、表面特征、质地、气味等方面。
18、 性状鉴别内容及描述方法: 一、性状鉴别的内容: 颜色:从单一色到组合色不等,如红色、深褐色,黄棕色 等。 形态:如液体可分黏稠液体、液体、澄清液体、澄明液体 等。 形状:如栓剂可分为球形、鱼雷形、圆锥形、卵形、鸭嘴 形等。 气:可分为香、芳香、清香、腥、臭、特异、气微、芳香 浓郁等。 味:可分为甜、酸、苦、涩、辛、凉、咸、辣、麻等。 其他:光泽感、滑腻感等。 * 二、各种剂型的性状描述 在中药制剂不同剂型,其性状描述不一定 相同。但在描述制剂性状特征时,应以中医药理 论为指导。 例如: 水丸 六味地黄丸:本品为灰棕色至黄棕色的水丸 ;气香,味微甜、苦。 牛黄解毒片:本品为素片或包衣片,素片或
19、除去包 衣后的片芯显棕黄色;有冰片香气,味微苦、辛。 糖浆剂 急支糖浆:本品为棕红色的粘稠液体;气 香,味甜、微苦、凉。 难点提示:中药制剂性状鉴别的描述应注意以传 统中医药术语来描述。 * 三、物理常数测定 一些中药制剂,还测定一 些物理常数(如折光率、旋光度 、比旋度、凝点、熔点、相对密 度等)。测定这些物理常数可以 作为定性鉴别的一种手段。 * 第二节 显微鉴别 中药制剂的显微鉴别:利用显微镜来 观察中药制剂中原药材的组织碎片、细胞 或内含物等特征,从而鉴别制剂的处方组 成。 凡以药材粉碎成细粉后直接制成制剂或 添加有部分药材粉末的制剂,由于其在制 作过程中原药材的显微特征仍保留到制剂
20、中去,因此均可用显微定性鉴别法进行鉴 别。 第二节 显微鉴别 特点及制片方法: 特点: F 中药制剂一般多由二味以上中药材制备而成,制剂中各原药 材和辅料的显微特征会产生相互影响或干扰。 F 由于制备工艺不同,有些药材本身原有的组织结构特征已不 存在。 在选择制剂的显微鉴别指标时,要对处方中各药味逐一分析 比较,考虑选用能相互区别,互不干扰,能表明该药味存在的显 微特征作为鉴别依据。 如:“蛇胆川贝散”中,川贝母仅用淀粉粒作为指标。“ 牛黄解毒片”中大黄用草酸钙簇晶作为鉴别特征。 黄芩、甘草、桔梗系经过水煎、过滤、浓缩至稠膏投料,因 为它们的显微特征已不存在,故药典没有规定它们的显微特征作 为
21、该制剂的鉴别特征。 制片方法: 中药制剂与中药材粉末相比较在显微鉴别时,制片 的方法也不尽相同。为了便于显微观察,制剂必须按不 同剂型经过适当预处理,然后按药材粉末的方法装片进 行观察。 Q 散剂、胶囊剂:取粉末少量,选用适当的试液处理 后直接进行显微观察。 Q 片剂:切开,刮取少量样品,观察;粉末及粗则先 研细;糖衣片除去糖衣再研细。 Q 水丸、颗粒剂:于乳钵内研成粉末后观察。 Q 蜜丸:可取1丸从正中切开后,刮取少量样品进行观 察 第二节 显微鉴别 但由于蜂蜜粘结药材粉末的细胞和组织,难于观察 ,故一般可采用下面几种方法使粘结组织解离后再进行 观察: # 氢氧化钾法:取蜜丸切开后,取适量于
22、试管中,加5氢氧化钾 溶液适量,加热至用玻璃棒挤压能离散为止,倾去碱液,加水洗涤 后,取出少量置载玻片上,用解剖针撕开,再加适当的试液处理后 观察。 # 硝铬酸法:取适量样品于试管中,加硝铬酸试液适量,放置, 至用玻璃棒挤压能离散为止,倾去酸液,加水洗涤后,照1法装置。 # 氯酸钾法:取适量样品于试管中,加硝酸溶液(12)及氯酸 钾少量,缓缓加热,待产生的气泡渐少时,再及时加氯酸钾少量, 以维持气泡稳定地发生,至用玻璃棒挤压能离散为止,倾去酸液, 加水洗涤后,照1法操作装置。 # 水溶法:把蜜丸切碎后,加水搅拌、洗涤后,放置在离心管中 离心分离沉淀,经过多次反复处理把蜂蜜除尽后再装片观察。 第
23、二节 显微鉴别 第二节 显微鉴别 难点提示: 在本法鉴别中,只有药材原有组织结构特 征能保留到制剂中,才有意义。故一般全部由溶 剂提取的制剂,不用此法进行鉴别。 不同剂型其制片方法不同。 应选择在该制剂中没有干扰又能表明该味 药存在的显微特征作为鉴别依据。 第三节 理化鉴别 概念: 中药制剂的理化鉴别: 利用物理的、化学的或物理化学的方法 对制剂中所含的化学成分进行定性鉴别, 从而判断制剂的真伪。 中药制剂的理化定性鉴别方法: 有一般化学反应法、升华法、光谱法和 色谱法等。其中以薄层色谱法最常用。 一、化学反应法: 样品提取: 1、以50%-70%乙醇回流提取:提取出多数化学成分; 2、以酸性
24、乙醇回流提取:检验酚类、有机酸、生物碱等; 3、以水提取:室温浸泡:检验氨基酸、蛋白质。 60热水提取:检验单糖、多糖、皂苷、鞣质及其 化苷类。 4、以乙醚提取:滤液检验酯、内酯、苷元; 药渣挥去乙醚,甲醇回流提取:检验各种苷类。 5、以升化法提取:升华的成分,如游离蒽醌苷元等。 6、以水蒸气蒸馏法提取:挥了性成分。 第三节 理化鉴别 为了提高一般化学反应法用于中药制剂鉴别的可靠 性,改善其专属性,应该注意以下几点: 应慎重使用专属性不好的化学反应,如泡沫生成 反应、三氯化铁显色反应等,因为中药材中蛋白质、含 酚羟基等类似成分的存在较为普遍。 在分析前对样品进行分离、精制,除去干扰鉴别 反应的
25、物质,借以改善鉴别方法的专属性。具体的分离 精制方法要与被鉴别成分的性质、干扰成分的性质和理 化反应对反应条件的要求相适应等。 采用阴性对照和阳性对照的方式,对拟定的鉴别 方法进行反复验证,防止出现假阳性。 第三节 理化鉴别 二、升华法 利用升华法来进行鉴别中药制剂中某些具有升华性质 的化学成分。 这些成分,在一定温度下能升华与其他成分分离,取 升华物 显微镜下观察有一定形状, 在可见光下观察有一定颜色, 在紫外光下观察显出不同颜色荧光, 或者加一定试剂处理后显出不同颜色或荧光。 第三节 理化鉴别 操作方法:取金属片,安放在圆孔(直径约2cm )的石棉板上,在金属片上放一小金属圈(内径约 1.
26、5cm,高约0.8cm),对准石棉板上的圆孔,圈内放 入预先研细成粉末的中药制剂一薄层,圈上放一载玻 片。在石棉板下圆孔处用酒精灯小心慢慢加热,火焰 距离石棉板约4cm,加热至粉开开始变焦,即去火冷 却,可见有升华物附着于载玻片上,将载玻片取下反 转,在显微镜下观察其结晶形状或者加适当试剂观察 其颜色反应。 除此外,尚可用其他装置进行鉴别。 第三节 理化鉴别 三、光谱法 利用光谱法对中药制剂进行定性鉴别, 主要有荧光鉴别法,可见紫外分光光度法 、红外分光光度法,而其它的鉴别法较少应 用。 (一)荧光法 (二)可见紫外分光光度法 (三)红外光光度法定性鉴别 第三节 理化鉴别 荧光法 1、适用范围
27、:组成中药制剂的中药材中含 有能产生荧光的化学成分。 2、操作方法:取制剂的提取液点在滤纸上 或试纸上,置紫外光灯下(365nm或254nm)观 察,或加一定试剂后再进行观察。 第三节 理化鉴别 第三节 理化鉴别 可见紫外分光光度法 中药材中有些化学成分在可见紫 外光区有选择性吸收,显示特征吸收 光谱曲线,不同的药材所含的成分不 同,在一定条件下利用这些吸收光谱 的特征,以鉴别制剂中的某些成分。 常见的鉴别方法有: 1、规定吸收波长法:(最常用)样品经适当处理后,测定 其吸收光谱,在一定波长处有最大吸收; 2、对照品对比法:取对照品或对照药材及供试品经处理后 ,制成对照品溶及供试品溶液,分别测
28、定吸收光谱,比较二者 吸收光谱的一致性; 3、规定吸收波长和吸收度法:取样品经处理后,测定吸收 光谱,在吸收光谱的规定波长下应有若干个吸收峰,并有相应 的吸收度值; 4、规定吸收波长和吸收度比值法:样品在一定波长下应产 生相应的吸收峰,并且吸收度与对照峰的吸收度比值应在一定 的范围之内,此法的条件是要有对照品或参照物; 5、多溶剂光谱法:选用不同极性的溶剂按一定次序提取样 品,将样品为分若干个溶剂组,然后测定各组的吸收光谱,根 据所得到的特征吸收光谱或导数光谱进行鉴别。 可见紫外分光光度法 (三)红外光光度法定性鉴别 1、在4000-400cm-1范围间测定中药制剂 样品红外吸收光谱。 2、制
29、样方法:取样品直接制样,或经溶 剂提取后制样。 3、该法具有取样少、快速、简便、准确 等特点,但目前用于中药制剂的鉴别报道不 多。 四、色谱法 纸色谱法 薄层色谱法 薄层扫描法 气相色谱法 高效液相色谱法 第三节 理化鉴别 (一)纸色谱法 纸色谱法系以纸为载体,以纸上所含水或其 他物质为固定相,用展开剂进行展开的分配色 谱。 用比移值(Rf)表示各组成成分的位置,但 由于影响比移值的因素较多,因而一般采用在 相同实验条件下与对照物质对比以确定其异同 。 (二)薄层色谱法 薄层色谱法,系将适宜的吸附剂或载体涂布 于玻璃板、塑料或铝基片上,成一均匀薄层。待 点样、展开后,与适宜的对照物按同法在同板
30、上 所得的色谱图对比,并可用薄层扫描仪进行扫描 ,用以进行中药制剂品的鉴别方法。 在中药制剂的鉴别,薄层色谱法为最常用的 方法。 为了提高试验的重要性及分离度,因此薄层 色谱有必要进行规范化的操作。 样品供试液的制备 薄层色谱法使用的材料 操作方法 薄层色谱图记录与保存 影响薄层色谱分析的主要因素 对照品选择 (二)薄层色谱法 1样品供试液的制备 1)样品供试液的的制备: 提取方法见第一章。 2)净化方法: 单一溶剂萃取法 分段萃取法 液液萃取法 固液萃取法 (二)薄层色谱法 (二)薄层色谱法 2薄层色谱法使用的材料 6 薄层板 6 涂布器: 6 点样器材: 6 展开箱(层析缸) 6 显色与检
31、测仪器 规格: 用10cm10cm,10cm15cm, 20cm10cm或20cm20cm的规格,要求 光滑平整,洗净后不附水珠,晾干。 可用手工自制板可预制板,最好使用厚 度为12mm的优质平板玻璃,普通窗玻璃 一般不宜用于制作薄层板。 薄层板 吸附剂或载体: 常用的有硅胶G、硅胶GF254, 硅胶H、硅胶HF254, 其次有硅藻土、硅藻土G,氧化铝,氧化 铝、氧化铝G、微晶纤维素、微晶纤维素 F254等。 其颗粒大小一般要求直径为1040m。 薄层板 最常用的吸附剂: 加有石膏作粘合剂的商品硅胶G, 加有荧光剂的硅胶GF254, 有的另加其他粘合剂如羧甲基纤维素钠 以加固薄层板面; 有的品
32、种要求使用加有酸(如硼酸), 碱(如氢氧化钠)或缓冲溶液等薄层板。 薄层板 涂布器 : 应能使吸附剂在玻璃板上涂 成一层符合厚度要求的均匀薄层 。 商品有手工、半自动薄层板涂 布器,涂布的厚度有固定厚度( 如25m)或可以调节的两种。 点样器材 : 最常用也最方便的是定量点样毛细管 (微升毛细管),规格有0.5l、1.0l 、2.0l、3.0l、4.0l、5.0l及l0l等 。要求是标示容量准确,管端平整光滑 ,管壁洁净,液流通畅,无堵塞,无污 染。 微量注射器 展开箱(层析缸) 应当用薄层色谱专用的展开 箱,有平底展开箱和双槽展开箱 ,还有一种水平或展开箱。 显色与检测仪器 喷雾法:喷雾瓶应
33、能在一定压力下使试 剂喷成均匀的细雾状。 浸渍法用浸渍槽为特制的浸渍槽,将展 开后的薄层板平稳放入有显色剂的浸渍槽 中数十秒至1分钟后取出(揩净薄层板背后 的残存试剂)显色。 操作方法: 薄层板的制备 点样 展开 检测 薄层板的制备 除另有规定外,一般制备方法为:将1份 吸附剂(如硅胶G)加3份左右的水在研钵 中用研杵沿一个方向充分研磨,调成均匀 糊状物,倒入已准备好的涂布器中,在玻 璃板上平稳地以直线方向移动涂布器,使 硅胶浆均匀地涂布。薄层厚度一般为0.2 0.3mm,涂布好的薄层板于室温下在水平 台上晾干,再在105110活化约30分钟 ,置干燥器中备用。 点样 除另有规定外,点样用的定
34、量微升 毛细管,按规定吸取溶液后,以垂直方 向小心接触板面使成圆点状,点样基线 与底边的距离,点样距离底边以1cm为 宜,点间距离视情况为1、1.5或2cm, 原点直径应不大于3mm;如样品容量 较大,或为了改善分离度,也可点宽约 23mm不同长度的条带。点样时须注 意尽量不要损害薄层表面。 展开 点样后的薄层板置入加有展开剂的薄 层展开箱中,密闭,一般采用上行展开, 薄层板浸入展开剂浓度一般要求溶剂最初 的前沿距原点约5mm,展开至规定开距后 立即将薄层板取出,晾干,以备检测。多 数品种展距79cm已够,需平衡者可在双 槽展开箱,如需达到饱和状态,可在展开 箱内壁贴一被溶剂湿润的滤纸使展开箱
35、易 于被蒸气平衡。展开剂要求新鲜配制。 检测 色谱斑点本身有颜色者可直接在日光 下观察色谱中的色斑; 本身在紫外光激发下可发射荧光者 可直接置紫外光灯下观察荧光色谱; 需加试剂后方能显色或发射荧光者, 则可将试剂用喷雾器均匀喷洒于薄层板 面(或用浸渍法),再按规定直接观察 或加热后观察。 薄层色谱图记录与保存 照相、数码照相、复印、 扫描或描画。 影响薄层色谱分析的主要因素 常规薄层色谱因为是一种“敞 开系统”的色谱技术,与柱色谱的 区别之一是除材料及器材以外,外 界环境条件对被分离物质的层析行 为影响很大,分离机制也很复杂; 操作技巧也明显的影响色谱质量; 样品的预处理及供试液的制备 中药的
36、成分复杂,未知成分 多,供试液中溶出的物质较多,其 中有欲测成分也有其他“杂质”,常 常由于相互干扰或背景污染而难以 得到满意的分离效果,故需对样品 进行适当提取净化处理。 薄层色谱的点样技术 一般在常规薄层板上原点的直径不大 于3mm,高效薄层板要求原点直径不大于 2mm; 点样量不宜过大,最好控制在10l以下 ; 如在一个位置重复多次点样时,须注意 尽量不要将原点点成一个空心圈; 选用溶剂沸点不宜太高(如正丁醇)或 太低(如乙醚)。 吸附剂的活性与相对湿度的影响 薄层板从干燥器中取出,自开 始点样到展开前,薄层板一般是暴 露在实验室的大气中,其活性取决 于实验室环境的相对湿度; 控制展开时
37、的相对湿度:采用一 定浓度的硫酸溶液或其他调节相对 湿度的无机盐水溶液控制湿度。 溶剂蒸气在薄层色谱中的作用 溶剂的蒸气相在展开箱中也参 与色谱的展开而形成三维的层析过程 ,从而对薄色谱的层析过程和结果有 很大的影响; 可采用预平衡等方法进行控制。 温度的影响 最直观的影响是被分离物 质的Rf值和物质的相互分离度 以及斑点的扩散等,故试验时 应注意温度的控制。 对照品选择 标准品对照:用已知中药制剂某一药材的某一有效 成分标准品制成对照液,与样品在同一条件下层析,比较 在相同位置上有无同一颜色(或荧光)的斑点,以此来控 制制剂中这种有效成分。 阴阳对照:由于中药制剂中许多化学成分和有效成分不
38、明确,有些已明确但又无标准品,可以采用阴阳对照法处 理。 采用对照药材和化学标准品同时对照。为了能够准确检 验出制剂投料的真实性,有时只投化学标准品无法鉴别出 来,如果增加原药材的阳性对照液对照就可以克服这一不 足之处。 阳性对照液制备:把制剂中要鉴别的某对照药材,按 制剂的制法处理后,以制剂相同的比例、条件、方法提取 ,取得提取液叫该味药的阳性对照液。 阴性对照液制备:从制剂处方中减少要鉴别的该味药 材,剩下其他各味药,按制剂方法处理后,以制剂相同比 例、条件、方法提取,所得的提取液,为该味药的阴性对 照液。 把样品和对照品阳性对照液在同一条件下层析,观察 在同一位置上有无相同颜色的斑点,以
39、决定样品中有无该 味药的成分。同理也可以用阴性对照液对照,层析后,阴 性对照液较样品减少的斑点,应为该味药所具有的成分的 斑点。一般情况下最好阳性和阴性对照液同时和样品对照 。 对照品选择 薄层扫描法 薄层扫描法系指用一定波长的光照射 在薄层板上,对薄层色谱有吸收紫外光或 可见光的斑点,或经激发后能发射出荧光 的斑点进行扫描,将扫描得到的图谱及积 分数据用于中药制剂的鉴别。 操作方法:薄层板制备、样品液与对照 液制备、点样、展开、显色(或定位)、 上机扫描、色谱峰确认。 本法主要用于定量,用于鉴别较少. 气相色谱法 在中药制剂的定性分析中,气 相色谱法较为常用,主要利用保 留值进行定性,多用已知物对照法 作为定性鉴别的依据。 最适宜的制剂样品为含有挥发 油或挥发性成分的制剂。 高效液相色谱法 利用化合物在特定的色谱柱上, 在一定条件下的保留值,将某一样品 与其对照品在同一条件下,进行保留 时间的直接比较作为鉴别依据。 高效液相色谱法不受样品挥发性 的限制,流动相,固定相可选择的各 类多,检测手段多样,所以应用范围 比气相色谱法广泛。 其他方法: 中药制剂的鉴别还可以使用: X射线衍射法、 导数光谱法、 指纹图谱法等方法进行鉴别。
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