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1、1,第十三章 可见分光光度法和 紫外分光光度法(spectrophotometry),2,分析化学,化学分析法,仪器分析法,光谱分析法,色谱分析法,质谱分析法,电化学分析法,核磁共振分析法,可见、紫外、红外分光光度法、荧光光度法、原子吸收法等,激光诱导荧光光谱的灵敏度已达10-22克,达到了检测单个分子的水平, 可用于癌症的早期诊断。,分光光度法是根据物质的吸收光谱和光的吸收定律,对物质进行定量、定性分析的一种仪器分析方法。,所选用的光源,紫外分光光度法,特点:灵敏度高-10-5 mol/L 10 -6 mol/L 相对误差小-2%5% 应用广泛-医药、卫生、环保、化工,可见分光光度法,红外分
2、光光度法,4,第一节 物质的吸收光谱 第二节 分光光度法基本原理 第三节 可见分光光度法 第四节 提高测量灵敏度和准确度的方法 第五节 紫外分光光度法简介(不要求),本章内容:,5,起源于比色法,试金石,6,1、溶液的颜色,互补色,溶液的颜色是由于它选择性地吸收了一部分光, 而呈现它的互补色,第一节 物质的吸收光谱,7,2、 物质对光的选择性吸收,(2)不同物质,它们的选择吸收性质不同,(1)同一种物质对不同波长光的吸光度不同。,(3)溶液的颜色并不是某一个波长,而是一个波长带。,8,分子吸收光谱产生:分子吸收外界能量(光、电、热)引起分子能级跃迁,从基态跃迁到激发态, E= E1 E2= h
3、 = =hc/ ,E = Ee + Ev + Er,微观(量子)解释:,11,吸光度,透光率,3、 物质的吸收光谱,12,吸收光谱 (absorption spectrum),最大吸光度相对应的波长称为最大吸收波长 ,max,光吸收曲线 用不同波长的单色光 照射某一物质测定吸光度, 以波长为横坐标,以吸光 度为纵坐标,绘制曲线, 描述物质对不同波长光的 吸收能力。,13,吸收曲线的形状和max 定性分析 溶液的浓度愈大Amax愈大(强度特征) 定量分析,吸收曲线作用:,14,第二节 分光光度法基本原理,一、透光率(transmittance)和吸光度(absorbance),I0 = Ia +
4、 It + Ir,则上式简化为 I0 = Ia + It,吸收池表面对入射光有反射等作用。为消除吸收池对光的反射等与被测物吸收无关的因素的影响,必须采用参比溶液校正:在相同的吸收池中装入参比溶液(又称空白溶液),调节仪器使透过参比池的吸光度为零(称为工作零点)。在此条件下去测待测溶液,则反射光强度大小近似可相互抵消(扣除参比)。,15,16,A = a b ,二、Lambert- Beer 定律,A = b c, = a M,T = 10 -bc,17,或a越大,表明溶液对光越容易吸收。 一般,大于103可用分光光度计测定。,或a与、溶剂或溶质种类、温度有 关,与c、b无关,吸光系数的讨论,1
5、8,朗伯-比耳定律的物理意义:当平行单色光通过单一均匀的吸光物质溶液时,溶液的吸光度与溶液浓度和液层厚度的乘积成正比。 朗伯-比耳定律是吸光光度法的理论基础和定量测定的依据。广泛地应用于紫外光、可见光、红外光区的吸收测量,也适用于原子吸收测量。,19,解: (1) A = a b 0.22 = a 2 140 10-6 a = 785.7L/g cm,(2) = a M = 785.7 112.4 = 8.83 104 L/mol cm,(3 A = - lgT = 0.22 lgT = -0.22, T = 10-0.22 = 0.60 = 60%,例1 Cd2+浓度为140mg/L,双硫腙
6、法显色测定波长为520nm,液层厚度2cm,吸光度为0.22,求a、 和T,20,例2 一有色溶液的浓度为c ,透光率为T ; 求浓度为原来的1/2时,透光率为多少?,解: T = 10 - bc c T,例3 有色溶液的液层厚度增加一倍后,透光率和 吸光度的 改变为多少?,解: T = 10 - bc b T A,1/2c,T 1/2,T2 2A,2b,21,第三节 可见分光光度法,一、分光光度计,22,分光光度计四大系统,数据处理器,23,1. 光源系统提供波长范围为3601000nm的连续光谱。 可见光光源为钨灯,要求强度高,稳定性好,2. 分光系统提供所需波长的单色光。 单色器由狭缝、
7、光栅和准直镜组成,要求适 当宽度的狭缝,以保证单色光光强和纯度,3. 吸收池用来盛放溶液的容器。 可见光区用光学玻璃,要求光洁、透明、相互匹配,4. 检测系统进行光电转换、信号放大及输出。 由光电管、放大器、指示器、数字显示器 和打印器等装置构成,24,1. 标准曲线法根据 Lambert- Beer Law,以该物质吸收光谱图中的,测定被测物质标准品配制的一系列浓度溶液的A。以A为纵坐标,以溶液浓度为横坐标,可得一条通过坐标原点的直线。然后,在相同的实验条件下测定被测液的A,在标准曲线上查出被测液的浓度,25,二、测定方法 可见紫外分光光度法主要用于定量分析,(一)标准曲线法,1、max为入
8、射光,2、配制溶液,并测吸光度,c1c2c3 A1A2A3,3、测待测样品的吸光度Ax,4、从工作曲线上查出cx,Ax,cx,26,第四节 提高测量灵敏度和准确度的方法,一、分光光度法的误差,(一)溶液偏离Beer定律引起的误差,(1)仪器有关的因素 (2)试样溶液有关的因素,27,难以获得真正的纯单色光,分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带,如何克服非单色光引起的偏离 1、应选择分辨率高的单色器。 2、工作波长为max(吸收曲线较平坦,即A很小,则可近似认为是单色光),(1)仪器有关的因素,28,(2)试样溶液有关的因素 (a)浓度,当溶液浓度c 10-2molL-1时,吸光质点间平均距离缩
9、小, 相邻质点间的电荷分布相互影响,从而改变它们对光的 吸收能力。,(b)体系(介质)不均匀,大部分被待测物质吸收,还有少部分光因折射、散射或反射而被损失,胶体溶液、乳浊液或悬浊液,(c)化学因素的影响,朗伯-比耳定律假定:所有的吸光质点之间不发生相互作用,31,用仪器测定时应尽量使溶液透光度值在 T =2065% (吸光度 A =0.700.20)。,(二)光度误差(光源不稳定、检测系统的测量误差等),32,三、选择合适的测定条件,(一)波长的选择,问:为什么通常选择波长为max的光作为入射光?,1、 在max处,溶液的吸光系数最大,测定的灵敏度最高。,2、在max附近,吸收曲线较平坦, 很小,测定误差小。,(二)空白溶液的选择,空白溶液(参比)以消除溶液中待测组分以外 (其它组分和溶剂)的吸收以及吸收池的反射 等所带来的误差。,1、溶剂空白,2、试剂空白,3、试样空白,34,spectrophotometry 分光光度法 absorption spectrum 吸收光谱 transmittance 透光率 absorbance 吸光度,
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