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1、第十三章 高效液相色谱法,第一节 液相色谱仪器 (high performance liquid chromatograph),液相色谱仪(1),液相色谱仪(2),液相色谱仪(3),液相色谱仪(4),二、高效液相色谱法的特点 (feature of HPLC),特点:高压、高效、高速、高沸点、热不稳定有机及生化试 样的高效分离分析方法。,三、流程及主要部件 (process and main assembly of HPLC),1.流程,2. 主要部件,(1) 高压输液泵 主要部件之一,压力:150350105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相(10m), 液体的流动相高速通过时,
2、将产生很高的压力,因此高 压、高速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性。,(2)梯度淋洗装置,外梯度: 利用两台高压输液泵,将 两种不同极性的溶剂按一定的 比例送入梯度混合室,混合后 进入色谱柱。 内梯度: 一台高压泵, 通过比例调 节阀,将两种或多种不同极性 的溶剂按一定的比例抽入高压 泵中混合。,(3) 进样装置,流路中为高压力工作状态, 通常使用耐高压的六通阀进样装置, 其结构如图所示:,(4) 高效分离柱,柱体为直型不锈钢管,内径16 mm,柱长5 40 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。,(5) 液相色谱检测器,a. 紫外检测器
3、应用最广,对大部分有机 化合物有响应。 特点: 灵敏度高; 线形范围高; 流通池可做的很小(1mm 10mm,容积 8L); 对流动相的流速和温度变 化不敏感; 波长可选,易于操作; 可用于梯度洗脱。,b. 光电二极管阵列检测器,紫外检测器的重要进展; 光电二极管阵列检测器:1024个二极管阵列,各检测特 定波长,计算机快速处理,三维立体谱图,如图所示。,光电二极管阵列检测器,c. 示差折光检测器 (differential refractive index detector),除紫外检测器之外应用最 多的检测器; 可连续检测参比池和样品 池中流动相之间的折光指数差 值。差值与浓度呈正比; 通
4、用型检测器(每种物质 具有不同的折光指数);灵敏 度低、对温度敏感、不能用于 梯度洗脱;偏转式、反射式和 干涉型三种。,示差折光检测器,d. 荧光检测器 (fluorescence detector),高灵敏度、高选择性; 对多环芳烃,维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。,第二节 主要分离类型与原理,一、液-固吸附色谱 (liquid-solid adsorption chromatography) 固 定 相:固体吸附剂为,如硅胶、氧化铝等,较常使用的是5 10m的硅胶吸附剂。 流 动 相:各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理:组分在固定相吸附剂上的
5、吸附与解吸; 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样,对具有 官能团的化合物和异构体有较高选择性。 缺 点:非线形等温吸附常引起峰的拖尾。,二、液-液分配色谱 (liquid- liquid partition chromatography),固定相与流动相均为液体(互不相溶); 基本原理:组分在固定相和流动相上的分配; 流 动 相:对于亲水性固定液,采用疏水性流动相,即流动相的极 性小于固定液的极性(正相 normal phase),反之,流 动相的极性大于固定液的极性(反相 reverse phase)。 正相与反相的出峰顺序相反; 固 定 相:早期涂渍固定液,固定液流失,较少采用; 化学
6、键合固定相:(将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶 (担体)表面的游离羟基上。C-18柱(反相柱)。,三、离子交换色谱 (ion-exchange chromatography),固 定 相:阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂; 流 动 相:阴离子离子交换树脂作固定相,采用酸性水溶液;阳离子离 子交换树脂作固定相,采用碱性水溶液; 基本原理:组分在固定相上发生的反复离子交换反应;组分与离子交换 剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。 亲和力大,保留时间长; 阳离子交换:RSO3H+M+=RSO3M+H+ 阴离子交换:RNR4OH+X-=RNR4X+OH- 应 用:离子及可离解
7、的化合物,氨基酸、核酸等。,四、离子色谱 (ion chromatography),离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一中技术, 其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换 容量的离子交换树脂作为柱填料,并采用淋洗液抑制技术和 电导检测器,是测定混合阴离子的有效方法。 有关内容将在第十章第六节中讲授。,五、离子对色谱 (ion pair chromatography),原理:将一种(或多种)与溶质离子电荷相反的离子(对离子 或反离子)加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水 性离子对化合物,使其能够在两相之间进行分配; 阴离子分离:常采用烷基铵类,如氢氧化四丁基铵或氢氧化十 六
8、烷基三甲铵作为对离子; 阳离子分离:常采用烷基磺酸类,如己烷磺酸钠作为对离子; 反相离子对色谱:非极性的疏水固定相(C-18柱),含有对离子 Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相,试样离 子X-进入流动相后,生成疏水性离子对Y+X - 后;在两相间分配。,六、排阻色谱色谱 (size- exclusion chromatography),固定相:凝胶(具有一定大小孔隙分布); 原 理:按分子大小分离。小分子可以扩散 到凝胶空隙,由其中通过,出峰 最慢;中等分子只能通过部分凝 胶空隙,中速通过;而大分子被 排斥在外,出峰最快;溶剂分子 小,故在最后出峰。 全部在死体积前出峰;可对相对分子质 量在1
9、00-105范围内的化合物按质量分离。,七、亲和色谱(AC) (Affinity chromatograph),原理:利用生物大分子和固定 相表面存在的某种特异性亲和 力,进行选择性分离。 先在载体表面键合上一种 具有一般反应性能的所谓间隔 臂(环氧、联胺等),再连接上配 基(酶、抗原等),这种固载化的 配基将只能和具有亲和力特性 吸附的生物大分子作用而被保 留。改变淋洗液后洗脱。,第三节 液相色谱的固定相与流动相,一、液相色谱固定相 (stationary phases of LC),1. 液-液分配及离子对分离固定相 (1)全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体;早期采用
10、100m的大颗粒,表面涂渍固定液,性能不佳已不多 见;现采用10m以下的小颗粒,化学键合制备柱填料;,(2)表面多孔型担体 (薄壳型微珠担体)3040m的玻璃微球,表面附着一层厚度为1 2m的多孔硅胶。 表面积小,柱容量底;,(3)化学键合固定相,化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相; a. 硅氧碳键型: SiOC b. 硅氧硅碳键型:SiOSi C 稳定,耐水、耐光、耐有机溶剂,应用最广; c. 硅碳键型: SiC d. 硅氮键型: SiN,化学键合固定相的特点,1)传质快,表面无深凹陷,比一般液体固定相传质快; 2)寿命长,化学键合,无固定液流失,耐流动相冲击; 3)耐水、耐光
11、、耐有机溶剂,稳定; 4)选择性好,可键合不同官能团,提高选择性; 5)有利于梯度洗脱;,存在着双重分离机制: (键合基团的覆盖率决定分离机理) 高覆盖率:分配为主; 低覆盖率:吸附为主;,2.液-固吸附分离固定相,种类:硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等; 结构类型:全多孔型和薄壳型; 粒度:510 m。,3.离子交换色谱分离固定相,结构类别: (1)薄壳型离子交换树脂 薄壳玻璃珠为担体,表面 涂约1%的离子交换树脂; (2)离子交换键合固定相 薄壳键合型;微粒硅胶键 合型(键合离子交换基团) 树脂类别: (1) 阳离子交换树脂(强酸 性、弱酸性) (2) 阴离子交换树脂(强碱 性、弱碱性),4
12、. 空间排阻分离固定相,(1)软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构; 水为流动相。适用于常压排阻分离。 (2)半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物,有机凝胶; 非极性有机溶剂为流动相,不能用丙酮、乙醇等极性溶剂 (3)硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等; 化学稳定性、热稳定性好、机械强度大,流动相性质影响小, 可在较高流速下使用。 可控孔径玻璃微球,具有恒定孔径和窄粒度分布。,二、液相色谱的流动相 (mobile phases of LC),1. 流动相特性 (1)液相色谱的流动相又称为:淋洗液,洗脱剂。流动 相组成改变,极性改变,可显著改变组分分离状况; (2)亲水性固定液常采用疏
13、水性流动相,即流动相的极 性小于固定相的极性,称为正相液液色谱法,极性柱也称正 相柱。 (3)若流动相的极性大于固定液的极性,则称为反相液 液色谱,非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上 的出峰顺序相反。,2. 流动相类别,按流动相组成分:单组分和多组分; 按极性分:极性、弱极性、非极性; 按使用方式分:固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂:己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙 腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动 相的极性或增加选择性,以改进分离或调整出峰时间。,3. 流动相选择,在选择溶剂时,溶剂的极性是选择的重要依据。 采用正相液-液分配分离时:首先选择中等
14、极性溶剂,若 组分的保留时间太短,降低溶剂极性,反之增加。 也可在低极性溶剂中,逐渐增加其中的极性溶剂,使保 留时间缩短。 常用溶剂的极性顺序: 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小),4. 选择流动相时应注意的几个问题,(1)尽量使用高纯度试剂作流动相,防止微量杂质长期累 积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 (2)避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱 子。如使固定液溶解流失;酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。 (3)试样在流动相中应有适宜的溶解度,防止产生沉淀并
15、 在柱中沉积。 (4)流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测 器时,流动相不应有紫外吸收。,一、影响分离的因素 (factors influenced separation),1. 影响分离的因素与提高柱效的途径 在高效液相色谱中, 液体的扩散系数仅为气体的万分之 一,则速率方程中的分子扩散项B/U较小,可以忽略不计, 即: H=A+Cu 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同,如图所示。,1)液体的黏度比气体大一百倍, 密度为气体的一千倍,故降低传质 阻力是提高柱效主要途径。 2)由速率方程,降低固定相粒度 可提高柱效。 3)液相色谱中,不可能通过增加 柱温来改善传质,恒温。 4)
16、改变淋洗液组成、极性是改善 分离的最直接的因素。,2. 流速,流速大于0.5 cm/s时,Hu曲线 是一段斜率不大的直线。降低流 速,柱效提高不是很大。但在实际 操作中,流量仍是一个调整分离度 和出峰时间的重要可选择参数。,3. 固定相及分离柱 气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱,其选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中,分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作,一般很少自行制备。,二、分离类型选择 (choice of separation types),三、 HPLC的应用 (application of HPLC),1. 环境中有机氯农药残留量分析 固定相:薄壳型硅胶(37 5
17、0m) 流动相:正己烷 流 速:1.5 mL/min 色谱柱:50cm2.5mm(内径) 检测器:差示折光检测器 可对水果、蔬菜中的农药残留量 进行分析。,2. 稠环芳烃的分析,稠环芳烃多为致癌物质。 固定相:十八烷基硅烷化键合相 流动相:20%甲醇-水 100%甲醇 线性梯度淋洗,2%/min 流 速:1mL/min 柱 温:50 C 柱 压:70 104 Pa 检测器:紫外检测器,四、制备型液相色谱 (preparative liquid chromatography),获得高纯物质(色谱纯)的有效方法。 半制备柱(内径8mm,长度1530cm),一次制备量 .11mg;,1. 色谱柱的柱容量(柱负荷) 对分析柱:不影响柱效时的最大进样量; 对制备柱:不影响收集物纯度时的最大进样量; 超载:进样量超过柱容量。柱效迅速下降,峰变宽。 超载可提高制备效率,以柱效下降一半或容量因子k降低10%为宜。,2. 液相制备色谱的方法,收集组分时,通常有以下情况: (1)可获得良好分离,主峰 使用制备柱,超载提高效率; (2)两主成分之间的小组分; 超载,分离切分使待分离组分成为 主成分(富集)后,再次分离制备。,3. 制备型液相色谱,制备型液相色谱:结构与分析型一样,但泵流量大、 进样量大、采用制备柱;柱后馏分收集器。 制备柱:内径2050mm,柱长50cm。,
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