引物设计几种引物设计软件的介绍及使用ppt课件.ppt
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1、引物设计,几种引物设计软件的介绍及使用,一、引物设计的原则,1.引物长度(15-30bp) 典型的引物18bp到24bp。引物需要足够长,保证序列独特性,并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交,降低了特异性,而且比短序列杂交慢,从而降低了产量。 2.引物GC含量 选择GC含量为40到60,可使Tm值最好接近72。 3.引物5端 设计5端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。,4.引物对3末端 避免引物对3末端存在互补序列,这会形成引物二聚体,抑制扩增。 避免3末端富含GC。
2、设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。 避免引物3端出现3个以上的连续碱基。如GGG或CCC,会使错误引发机率增加。 引物3端不能选择A,最好选择T。A的错配几率最高,T最低。 5. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。否则易形成Hairpin 结构,影响引物与模板的复性结合 。若是不可避免,应选择3端G 4.5kcal/mol 的引物。 一般经验性原则:以所有结构的G 9kcal/mol 为底线,二、引物设计的方法,1. PC设计 利用下载的引物设计软件,自己设计所需引物。 引物设计的软件:prime primer、oligo、DNAstar等 2. 在线引物设计 Primer3 、
3、Primerfinder、codehop 等等。,Prime Primer5.0 的应用,参数设置,单击,单击,引物选择,选择标准,1.无二级结构(所有按钮都不是红色显示) 2.产物所处位置是否满足要求。 3. 两条primer 的Tm值相差不超过3,最好在1内。引物的Tm值最好不低于60 ,以保证产物的特异性。 4.引物GC含量是不是在4060间。,若是没有办法完全满足以上要求,则按照引物设计原则中G 要求选择引物。,引物编辑功能,按顺序点击,利用primer primer5.0 进行 巢式PCR引物的设计,Search Primer 操作后,上游引物,下游引物,点击三角符号可出来相应的引物
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