液相色谱方法开发new0603ppt课件.ppt
《液相色谱方法开发new0603ppt课件.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《液相色谱方法开发new0603ppt课件.ppt(45页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、液相色谱的应用以及方法开发,提 纲:,一.HPLC的应用 二.方法开发过程 1)选择HPLC检测器 2)方法开发的具体步骤 3)梯度洗脱方法,一.HPLC的广泛应用,据2008年统计,世界上化合物总数多达5000多万种 在全部有机化合物中仅有20左右的样品适用于GC分析 而HPLC可对80左右的有机化合物进行分离和分析,HPLC的广泛应用,HPLC特别适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物以及生物活性物质的分离和分析并且可以做制备 在医药、食品、农业、生命科学、化工、环保等领域都有着广泛的应用潜力。,HPLC的应用领域,在食品研究中的分析应用 食品中的天然成分 碳水化合物 类脂化合物
2、、甘油三酸酯、胆固醇 脂肪酸和有机酸 蛋白、肽、氨基酸 食品添加剂 酸味剂、甜味剂、香精、乳化剂 抗氧化剂、防腐剂 颜料和染料(色素 维生素 污染物 霉菌(黄曲霉毒素 农药残留和兽药残留 多环芳烃(PAHS和亚硝酸,HPLC的应用领域,在医药研究中分析应用 药物分析有USP、BP、CP等标准 常用药物研究中的应用:解热镇痛药、镇静药、安定药、心血管药、磺胺类消炎药等。 甾体药物研究中的应用:肾上腺皮质激素、雄性激素、雌性激素和孕激素等。 抗菌素类药物研究中的应用:青霉素、头孢菌素、庆大毒素、四环素、氯霉素、诺氟沙星等。 中草药研究中的应用:生物碱、甙类(皂甙、强心甙、黄酮甙等)、萜类 手性药物
3、研究中的应用:光学异构体的拆分(如解毒剂D-青霉胺毒性小,L-异构体毒性很强) 医疗药物的检测、新药研究、药物代谢、药代动力学研究。 在兽药研究中分析应用,HPLC 的应用领域,在生物化学和生物工程中的应用 氨基酸、多肽合成和蛋白质的分析研究 核碱、核苷、核苷酸和核酸的分析研究 生物胺的分析研究(儿茶酚胺类) 在精细化工分析中的应用 醇、醛和酮、醚的分离分析 酸和酯的分离分析 表面活性剂的分析 聚合物的分析研究 药物、农药、染料、炸药等工业产品,HPLC的应用领域,化妆品行业要控制和分析: 防腐剂、防晒剂、性激素以及维生素等; 在公安、刑警破案工作需要 投毒药物、毒品分析等 在环境污染分析中的
4、应用 废气、废水、废渣中多环芳烃、多氯联苯、农药残留、酚类和胺类的检测,在无机离子分析中应用 饮用水、酸雨、土壤中阴离子和阳离子分析,二.方法开发的过程,Adapted from: Snyder, L.R.; Kirkland, J.J.; Glajch, J.L; Practical HPLC Method Development 2nd Ed., Wiley-Interscience, New York, 1997, p. 2,第一步干什么?,想办法得到各种信息 向同行了解是否做过此类样品,或有否类似样品的分析方法 查文献和方法,如CA,AA,AOAC,EPA- 仪器制造商的文献,如Dio
5、nex,Waters 对色谱柱有足够的了解 掌握分离机理,自己开发方法 充分了解您自己的样品,分析时要了解哪方面的情况?,灵敏度的要求有多高? 样品的本底是否很复杂? 有多少组份要分析? 对分析的精确度、准确度等有多高要求? 是否因是日常检验,而要求方法容易使用?,分离(制备)时要了解哪方面的情况?,要分离(即制备)的样品量有多大? 要分离的组份在样品中的含量很高? 还是微量? 是否需要保持生物活性? 对分离产物纯度的要求有多高? 纯度或活性的鉴定如何完成?,使用文献方法注意点,色谱柱填料的种类、品牌是否相同? 注意文献方法的流动相 是否损害色谱柱? 如色谱填料品牌不同,需要调整流动相 注意色
6、谱柱的规格:内径、柱长 需要调整流速、进样量 注意梯度条件 了解系统的滞后体积(梯度),1)选择HPLC检测器,对样品有响应并有一个输出信号 应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性关系;并且所设计的校正技术应该促进这种关系 但是: 由于受HPLC系统其他部件的影响会产生响应与浓度之间关系的与线性偏离现象 并不是所有的检测器是线性的 受HPLC系统其他部件的影响,检测器的表现可能与其最佳水平有较大的差距,2)方法开发一般的具体步骤,先用一根短的色谱柱 用相对较高的流速 使用尽可能纯度高的标准品 先用高强度的洗脱液 调节k 值改变保留值 调节a值改变选择性 通过改变流动相的pH值,使样品成中性
7、 加入“对离子”,使样品呈中性 调节柱长度改变柱效及分离速度,反相色谱的方法开发,开发过程实例 色谱条件 色谱柱:C18,4.6mm15mm 流动相:乙腈/水,乙腈从100%逐渐降低(或走梯度) 举例中用不同的溶剂强度,60/40、50/50、40/60,由强渐弱 流速:1ml/min,方法开发的其他因素,流速对柱效的影响 不同内径的色谱柱有自己的最佳流速 样品的进样量(浓度)对柱效的影响 样品的进样体积对柱效的影响 溶剂粘度对柱效的影响 以上因素均影响分离度,3)液相色谱的方法开发,梯度洗脱法,液相色谱泵,稳定平滑并且重现性好的流速 可靠且充分的溶剂混合 准确及重现的自动溶剂混合 准确及重现
8、的梯度形成 有效的流速范围 制备色谱或微柱、窄柱色谱要考虑 滞后体积 梯度分析更为关注 目的:在任何情况下保持最高精度,梯度的洗脱方式,高压梯度及低压梯度,梯度:高压混合,高压梯度 使用多台色谱泵,在泵后混合 配置灵活、简单,脱气简单 易调节梯度的滞后体积,梯度:低压混合,低压梯度 用单泵产生梯度,泵前(低压端)混合 对脱气要求高 不易调节梯度的滞后体积 如设计不当,梯度的 准确性受影响 滞后体积(系统 体积)设计合理,梯度滞后:系统体积的影响,注意滞后体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路,梯度滞后大小的影响,滞后体积太大会引起梯度变化的延迟 例如:滞后体积为2.0ml,流速1.0ml/m
9、in 实际梯度会比设置值晚 2 分钟响应,没有问题 对微柱色谱影响更大,同上例但流速0.1ml/min 实际梯度会比设置值晚20 分钟响应,不能接受 滞后体积的不同会使方法转换麻烦 滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现 滞后体积的变化会导致梯度重现性不好 普通分析型液相色谱的滞后体积为14ml(4元泵400l,高压泵150l ),滞后体积变化的影响,设计不好的HPLC系统,滞后体积随反压变化 滞后体积随反压变化的后果: 梯度的准确性不好,造成:方法的适应性不好 用静态梯度混合器;固定滞后体积可明显改善梯度特性,色谱柱反压变化对梯度实验的影响,without pulse damper Back
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 色谱 方法 开发 new0603ppt 课件
链接地址:https://www.31doc.com/p-2667310.html