第三章蛋白质.doc
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1、第三章 蛋白质在构成生物体的大分子中,蛋白质是一类极其重要的物质,是构成细胞内原生质的主要成分之一,并且和生物体性状的表达直接相关,因而它在生物体内具有特殊重要的地位。蛋白质分布非常广泛,它存在于一切生物体内。但是不同生物体内蛋白质的含量差别很大。动物和微生物中蛋白质含量较高,人体干重的45%是蛋白质,而在啤酒酵母中比例达到50%左右。在植物体内由于糖类物质含量高,蛋白质的含量较低,在大麦中的含量约为10%。第一节 蛋白质的组成及功能作为新陈代谢的催化剂酶运输蛋白:血红蛋白,膜内的多种转运蛋白贮藏蛋白:肌红蛋白,铁蛋白一些蛋白质参加免疫反应:免疫球蛋白,凝血酶,光受体蛋白,胆碱酯酶起调控作用的
2、蛋白质:阻遏蛋白,组蛋白,鸟苷酸结合蛋白结构蛋白: 胶原蛋白,弹性蛋白蛋白质化学组成蛋白质主要由碳、氢、氧、氮四种元素组成,此外还有少量的硫以及磷、铁、铜、碘、锌、锰、钼、钴、镁、钙等。氮元素是蛋白质区别于糖类、脂类的特征性元素,它在各不同蛋白质中的含量相对稳定,平均为16%左右。生物样品中每存在1克氮元素可粗略认为含有6.25克蛋白质。测定蛋白质含量的常用方法:凯氏定氮法。首先用浓硫酸将有机态的氮转化为无机态的氨,然后用标准浓度的盐酸滴定氨从而计算出氮的含量,利用公式:粗蛋白含量% = 氮%6.25蛋白质的分子大小 蛋白质是分子量很大的生物分子,不同的蛋白质分子量相差悬殊,从大约6,000到
3、1,000,000道尔顿(Da)或更大。而分子量小于6,000的人们一般称之为肽。蛋白质的分类 依据分子形状分球状蛋白质:分子对称性好,外形接近于球状或椭球状,如血液中的血红蛋白。球状蛋白质的特点是溶解度较好,能结晶,大多数蛋白质属于这一类。纤维状蛋白质:分子对称性差,外形类似细棒或纤维状,如血液中的血纤维蛋白原,外形如同细长的纺锤体,表现出高度的不对称性。纤维状蛋白质有的能溶于水,如肌球蛋白、血纤维蛋白原等,而大多数不溶于水,包括胶原蛋白、弹性蛋白、角蛋白、丝心蛋白等,它们在生物体内的功能往往是起保护作用。依据分子的化学组成分单纯蛋白质:是完全由氨基酸组成的。结合蛋白质:是由氨基酸组成的蛋白
4、质部分和由辅基组成的非蛋白部分共同组成的。依据生物功能分类 活性蛋白质:酶、激素、运输蛋白、受体蛋白、膜蛋白。非活性蛋白质:在生物体内起保护或支持作用,如角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、丝心蛋白等。第二节 氨基酸一、蛋白质的水解 蛋白质分子多肽寡肽二肽氨基酸 根据蛋白质被水解的程度,可分为完全水解和不完全水解。完全水解指的是将蛋白质水解到最大程度,得到的水解产物是各种氨基酸的混合物。不完全水解或称部分水解是将蛋白质进行一定程度的水解,得到的产物是各种大小不同的肽段和氨基酸的混合物。微生物培养中常用的酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等都是蛋白质不完全水解的产物。在使用稀酸、稀碱或较单一的酶进行较长时间的保温,
5、可使蛋白质发生不完全水解,生成多肽、寡肽和氨基酸的混合物。很多蛋白质的不完全水解产物是重要的工业产品,在生物、医药等多种领域中广泛使用。蛋白质发生水解的程度可以用水解度(degree of hydrolyzed,简写为DH)来表示,水解度定义为蛋白质水解后游离氨基氮与总氮的比值,或断裂的肽键数与总肽键数的比值。 式中游离氨基氮可通过范氏定氮法或甲醛滴定法测定,而总氮可通过凯氏定氮法测定。二、氨基酸的分类和结构已发现的氨基酸有180多种,参与蛋白质组成的常见氨基酸只有20种,在某些蛋白质中存在若干种不常见氨基酸。常见氨基酸是由生物遗传密码直接编码的,不常见氨基酸都是在已合成的肽链上由常见氨基酸经
6、专一酶催化修饰转化而来的。不参与蛋白质组成的氨基酸被称为非蛋白质氨基酸。氨基酸的结构通式在氨基酸分子中,与功能基团(一个羧基和一个氨基)以共价键相连接的中心碳原子称为碳原子。与碳原子共价键相连的还包括一个氢原子和一个以字母R表示的化学基团,R基是连接着其他功能基团的一个碳或一个碳以上的碳链(甘氨酸例外)。不同氨基酸其R基各不相同。R基的结构决定了20种氨基酸的特殊性质。除了甘氨酸外,其余氨基酸的-碳原子都是一个手性碳原子。组成蛋白质的常见氨基酸 人体必需氨基酸 在20种常见氨基酸中有八种氨基酸在人体内不能通过别的物质转化而合成,或者不能足量合成,必须从食物中获取,它们被称为必需氨基酸。这八种必
7、需氨基酸是苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸和甲硫氨酸。 三、氨基酸的理化性质物理性质晶体形状:各种常见氨基酸均为无色结晶,但各种氨基酸晶体的形状各不相同,可作为氨基酸定性的依据。熔点:氨基酸分子以兼性离子形式存在,熔点较高,一般在200-300之间。溶解度:氨基酸分子内都具有-氨基和-羧基等极性基团,因而能溶解于水,但酪氨酸在水中溶解度很小。所有的氨基酸都易溶于稀酸或稀碱溶液中,而不溶于乙醚、氯仿等非极性溶剂。旋光性:除了甘氨酸外,其它氨基酸的-碳原子都是不对称碳原子,因此这些氨基酸都具有旋光性。 紫外吸收性质 20种氨基酸,在可见光区域都没有光吸收,在近紫外光区域(
8、介于220- 300nm)酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收能力。 酪氨酸: max=275 nm,275=1.4103 苯丙氨酸:max=259 nm,259=2.0102 色氨酸: max=280 nm,280=5.6103 色氨酸紫外吸收能力最强。蛋白质由于含有这些氨基酸,所以有紫外吸收能力,一般最大光吸收在280nm处,因此能利用紫外分光光度法很方便的测定蛋白质的含量。化学性质氨基酸的酸碱性质 氨基酸是一类两性物质,既能解离出质子起酸的作用,又能接受质子起碱的作用。两性电解质 氨基酸的甲醛滴定氨基酸既是酸又是碱,理论上可以用标准浓度的NaOH溶液进行滴定。但氨基的存在使得不能直接用NaOH
9、来滴定氨基酸。在中性pH条件下,往氨基酸溶液中加入过量的甲醛,能与-NH2很快反应生成羟甲基衍生物和二羟甲基衍生物。甲醛滴定法是一种常用的测定溶液中氨基酸含量的方法,测得结果常用氮含量来表示氨基酸含量,称为甲醛氮。此法操作简便,但精确度不高,会有一定的误差。氨基酸的化学反应与亚硝酸反应 生成的氮气分子中一半的氮来自氨基酸,另一半来自亚硝酸。通过气体分析仪器测定标准状态下产生氮气的体积,根据气体的摩尔体积换算成氮气的摩尔数,可以计算出氨基酸(氨基氮)的含量,这是范氏定氮法的基础。20种常见氨基酸中脯氨酸是一种亚氨基酸,没有游离-氨基,因而不能与亚硝酸发生该反应。 形成西佛碱 氨基酸的-氨基能与醛
10、类化合物反应,生成弱碱,称为西佛碱。脱氨基反应 氨基酸在氧化剂或氨基酸氧化酶的作用下发生氧化脱氨生成相应的-酮酸。 成盐和成酯反应氨基酸与碱作用即生成盐,例如和NaOH作用得到氨基酸的钠盐。调味品味精就是谷氨酸单钠盐。脱羧基反应茚三酮反应 在弱酸性溶液中将-氨基酸与茚三酮一起加热,发生较为复杂的氧化还原反应,氨基酸发生氧化脱氨、脱羧,生成相应的醛、氨和二氧化碳,茚三酮被还原生成还原茚三酮。而后还原茚三酮、氨和水合茚三酮共同作用生成一种蓝紫色的物质。 茚三酮反应非常灵敏,几微克的氨基酸即可与茚三酮显色,因而该反应被应用于氨基酸的定性定量分析。该蓝紫色物质在570nm波长下有最大光吸收,在0.5-
11、50g/mL范围内,氨基酸的含量与吸光度成正比。另外通过测定反应生成CO2的量,同样也可以计算出氨基酸的含量。脯氨酸是亚氨基酸,与茚三酮反应并不释放氨气,也不会生成上述蓝紫色物质,而是直接生成一种黄色化合物,此化合物的最大吸收波长出现在440nm处。成肽反应 一个氨基酸的氨基和另一个氨基酸的羧基之间脱水缩合生成的酰胺化合物称为肽,形成的酰胺称为肽键。由两个氨基酸组成的肽称为二肽。 两种不同的氨基酸之间可以形成两种二肽。三种不同的氨基酸之间可以形成六种三肽,而n种不同的氨基酸之间可以形成n!种不同的多肽。这也是蛋白质种类极其多样化的原因。四、氨基酸的分离和分析鉴定纸层析 这是一种典型的分配层析。
12、以滤纸作为惰性支持物,滤纸和水有很强的亲和力,其中一部分水分子是以氢键同滤纸中的纤维素分子结合的,这部分结合水作为层析中的固定相,而进行展层所用的有机溶剂作为流动相。不同的氨基酸分子由于侧链基团不同,极性不同,它们在固定相和流动相中的溶解度是不同的。RfX/Y 如果需要定量测定某种氨基酸,可在层析后将该氨基酸对应的斑点剪下,用一定的溶剂(如1%硫酸铜酒精溶液)浸泡洗脱,用分光光度计在520nm测定吸光度,在标准曲线上可求得含量。 纸层析法是分离鉴定微量氨基酸的最为简单有效的方法,该方法不能用于大量氨基酸的分离纯化。薄层层析 以纤维素粉、硅胶、氧化铝等作为支持物,将支持物均匀涂布在玻璃板等载体上
13、制成薄层,将氨基酸混合物点样到薄层上,以结合在薄层上的结合水作为层析中的固定相,而有机溶剂作为流动相进行展层,由于不同的氨基酸在两相中的溶解度不同,也即分配系数不同,在展层中移动速度不同而得到分离。薄层层析分辨率高于纸层析,需要样品的量极少,0.1至几个微克的样品即可进行分离分析,且层析速度很快,设备简单,操作方便,因而是对氨基酸定性定量分析的常用方法。 离子交换层析 这是一种以离子交换剂作为支持物和固定相,以不同pH和离子强度的缓冲液作为流动相的层析技术。根据引入基团的种类,离子交换树脂分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。 当引入基团是酸性基团,它们在溶液中电离后带负电荷,能和溶液中带正电荷
14、(阳离子)的物质结合,因而称为阳离子交换树脂。 当引入基团是碱性基团,它们在溶液中电离后带正电荷,能和溶液中带负电荷(阴离子)的物质结合,因而称为阴离子交换树脂。 氨基酸分子上的净电荷取决于氨基酸的等电点和溶液的pH值,所以当溶液的pH 值较低,氨基酸分子带正电荷,它将结合到强酸性的阳离子交换树脂上;随着通过的缓冲液pH逐渐增加,氨基酸将逐渐失去正电荷,结合力减弱,最后被洗下来。由于不同的氨基酸等电点不同,这些氨基酸将依次被洗出,最先被洗出的是酸性氨基酸,如Glu(在约pH34时),随后是中性氨基酸,如Gly和Ala。碱性氨基酸如Arg和Lys在pH值很高的缓冲液中仍带有正电荷,因此这些在约p
15、H值高达1011时才出现。 高效液相色谱(HPLC) 高效液相色谱采用的层析介质颗粒很细,表面积很大,具有很高的分辨率。但是流动阻力很大,因而洗脱速度很慢,通过对溶剂系统采用较高的压力,可以有效的增加洗脱速度。 将氨基酸混合物与苯异硫氰酸酯(PITC)反应生成PTH-氨基酸(苯氨基硫甲酰氨基酸),这种衍生作用使得PTH-氨基酸在紫外区有光吸收,从而大大提高了氨基酸检测的灵敏度,即使是极微量的氨基酸样品也可以分离纯化和定量。各种PTH-氨基酸再经过HPLC可以完全分开,通过测定紫外区的光吸收进行定量。有些氨基酸分析仪已经使用该方法进行分离、分析测定。第二节 蛋白质的结构 蛋白质结构根据其复杂性分
16、为:一级结构、二级结构、三级结构和四级结构,蛋白质的二级、三级、四级结构统称为高级结构或空间结构。 蛋白质空间结构的稳定性主要依靠大量弱的相互作用即非共价键也称次级键来维系,包括氢键、疏水相互作用、盐键、范德华力。此外,还有两种共价键二硫键和配位键在维持某些蛋白质的构象方面也起着重要作用。一、蛋白质一级结构蛋白质的一级结构又称为共价结构,是指肽链中的氨基酸顺序。蛋白质一级结构研究的内容不仅包括肽链中的氨基酸顺序,还包括了蛋白质分子中多肽链的数目,每条肽链的氨基酸残基的种类,多肽链内和链间二硫键的位置等。胰岛素第一个被阐明一级结构的蛋白质是牛胰岛素,由英国的Sanger等人在1953年完成,是蛋
17、白质化学研究史上一项重大成就。胰岛素是由哺乳动物胰脏的细胞分泌的对糖代谢起重要调节作用的激素。牛胰岛素的分子量为5,700Da,由51个氨基酸残基组成。这51个氨基酸形成两条多肽链,分别称为A链和B链,其中A链由21个氨基酸残基组成,B链由30个氨基酸残基组成。A链和B链通过两个链间二硫键连接起来,分别是A7(A链第七个氨基酸是Cys)和B7,A20和B19之间形成的二硫键。此外,A链的A6和A11之间还形成一个链内二硫键。蛋白质一级结构与功能的关系蛋白质的一级结构对于蛋白质分子的生物功能至关重要,一级结构决定了高级结构,一级结构决定了功能。蛋白质的一级结构中各个氨基酸残基的地位和作用并不是等
18、同的。一级结构中有些位点上的氨基酸残基可以被其它氨基酸残基取代,甚至成片缺失,并不影响或很少影响蛋白质的生物功能,这些位点的氨基酸称为可变氨基酸。一级结构中另一些位点上的氨基酸残基的保守性很强,一旦被取代或缺失,将导致蛋白质生物活性的严重降低甚至丧失,这些位点的氨基酸称为保守氨基酸。47血红蛋白分子共有574个氨基酸残基组成,仅仅亚基上改变了一个氨基酸残基,生理功能就发生了很大的变化,可见蛋白质的一级结构对功能的影响之大。二、蛋白质的二级结构蛋白质的肽链是由各种氨基酸按一定顺序排列而形成的,但天然蛋白质并不是线性的结构,多肽链的主链及侧链中含有大量的单键,这些单键周围的原子和原子团绕轴旋转,就
19、能产生特定的空间构象,蛋白质的高级结构研究的就是这些空间构象。蛋白质的二级结构是指肽链的主链借助氢键有规则的卷曲折叠成沿一维方向具有周期性结构的构象。因而它研究的内容是肽链的共价主链,而不涉及侧链R基团的空间排布。1. 肽平面 肽键具有部分双键的性质,是不能绕轴自由旋转的,因而作为肽链中的基本单位(肽单位)的六个原子处在同一平面上,称为肽平面,又称酰胺平面。2. 二级结构的基本类型 基本的二级结构主要有:a-螺旋(a-helix)、-折叠(-sheet)、-转角(-turn) 、无规卷曲(random)等。a-螺旋 a-螺旋是蛋白质分子中最常见最稳定的一种二级结构构象。它是多肽主链环绕一个中心
20、轴有规律的盘旋前进形成的螺旋型构象。该螺旋最初在a-角蛋白中被发现,故称a-螺旋。螺旋(a)仅显示碳原子;(b)显示肽主链折叠方式(c)完整结构,红色显示主链氢键a-螺旋的结构特点 :形成-螺旋时,每个氨基酸残基上的Ca的一对二面角和取值是恒定的,=57,=47。主链绕中心轴按右手方向盘绕,每上升一圈包含3.6个氨基酸残基,螺距为0.54nm,平均每个残基旋转100,上升0.15nm。螺旋的稳定靠大量氢键来维持。-折叠-折叠是一种较伸展的构象,由两条或两条以上的肽段充分伸展并侧向聚集,按肽链长轴方向平行排列在一起,相邻肽链的羰基和亚氨基之间形成有规则的氢键的一种折叠式片层结构。分为平行式和反平
21、行式。 -折叠的结构特点 与Ca相连的氨基酸残基的R基交替的出现在片层的上方和下方,并且均和片层相垂直。从能量上看,反平行式要比平行式更稳定。平行式-折叠中,所有肽链的N-末端都在同一侧,而C-末端都在另一侧,每个氨基酸残基上的Ca的一对二面角=119,=113。反平行式-折叠中,肽链的走向一顺一反,N-末端间隔同向,而相邻两条肽链的走向总是相反的,每个氨基酸残基上的C的一对二面角=139,=135。三、蛋白质的三级结构球状蛋白质在一级结构和二级结构的基础上,再进行三维多向性盘曲形成近似球状的构象被称为蛋白质的三级结构。二级结构讨论的是共价主链的构象,三级结构则涉及主链和侧链所有原子和原子团的
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