酶工程研究及应用.doc
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1、酶工程研究及应用陈红霞山东济宁职业技术学院生物化学工程系 济宁 272037摘要:酶工程是现代生物技术的重要组成部分,它作为一项高新技术将为各工业的发展起重要推动作用。介绍了酶固定化、基因工程菌(细胞)的固定化、植物细胞培养产酶、酶的化学修饰、核酸酶、抗体酶、酶标药物的理论和技术研究的最新进展以及酶工程在各工业中的应用,对酶工程的发展前景进行了探讨。关键词:酶工程;酶的固定化;核酸酶;抗体酶,应用Research and Application of Enzyme Engineering CHEN Hong-xiaBiology chemistry Department of Jinning
2、Vocational and Technological College Jinning 272037Abstract:Enzyme engineering is an important composing part of modern biotechnologies,it will take great effect in industry as a new technologyThe new advance in enzyme engineering research includes such as enzyme immobilizatio ,immobilizatio of gene
3、tically engineered microorganism(cell),enzyme production by plant cell culture,chemical modification of enzymes,ribozyme ,abzyme ,enzyme labelling drug and the application of enzyme engineering in industryThe prospects of enzyme engineering are also exploredKey words:enzyme engineering;enzyme immobi
4、lizatio; ribozyme;abzyme;application1酶工程技术1.1固定化酶和固定化细胞固定化酶是指将可溶的自然酶束缚在特定的支持物上或固定在局限的空间,并能发挥催化作用,而固定含酶的细胞则形成固定化细胞。我国研制过的固定化酶或细胞已有五十种左右,可以分为下述三种类型:固定化单酶或含特定酶的细胞;固定化双酶,将两种酶共固定在一种载体上或分别固定后串联在一起使用;固定化各类激酶构成ATP再生系统。目前已有多种固定化生物催化剂用于医药工业化生产。与天然酶相比,固定化酶和固定化细胞有酶稳定性高,可长期反复使用,利用效率高;反应后酶与产物易分离,可装柱进行反应,实现连续化操作及自
5、动控制,设备小型化,节约能源和人力;转化液中产物浓度高,副产物少,产品易纯化,产品收率和质量高,成本低;绿化生产,无三废污染;可与溶菌酶共固定化或向反应液中加入抑菌剂,抗微生物污染能力强等生产优点。固定化的方法主要有吸附、共价结合、包埋和选择性热变性等。固定化过程必须使用水不溶性固体支持物(载体)。载体要有良好的稳定性,对酸碱和温度有一定耐受性及亲水性,有一定的疏松网状结构和机械强度,颗粒均匀,能耐受酶和微生物作用,共价结合时有可活化基团,廉价易得。吸附法是利用吸附剂、表面作用力或离子交换剂电性作用将酶(细胞)定位于载体表面的技术,当底物或产物为大分子或水溶性较差的小分子物质时,常采用此法制备
6、固定化生物催化剂。常用载体有活性炭、氧化铝、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、硅胶、石英砂、Amberlite IRA、AmberliteIR、DEAE-纤维素、CMC、DEAE-Sephadex等,如硅皂土或膨润土吸附青霉素酰化酶和DEAE-Sephadex A25吸附氨基酰化酶等1。共价结合法是将酶(细胞)与载体之间通过共价健结合而固定的技术,酶(细胞)与载体结合牢固,不易脱落。常用的载体有纤维素、琼脂、对氨基苯磺酰(ABSE)-纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、对氨基苯纤维素及苯胺多孔玻璃等,如ABSE-纤维素与5-磷酸二酯酶或多核苷酸磷酸化酶的共价结合物、纤维素与葡萄糖氧化酶的共价结合物等。包埋法是
7、将酶(细胞)限制于凝胶网格内或微囊中的技术,如底物及产物为易溶于水的小分子时,可采用此法制备固定化生物催化剂。载体有聚乙烯醇、卡拉胶、海藻胶、琼脂、血纤维、胶原蛋白、聚丙烯酰胺凝胶、丙烯酸高聚物等,如聚丙烯酰胺凝胶包埋D-果糖二磷酸醛缩酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和卡拉胶包埋黄色短杆菌、E.coli等。选择性热变性技术是将酶限制于细胞内,但细胞内酶不变性的技术,如将白色链球菌于60加热10min即成为具有葡萄糖异构酶活性的固定化白色链球菌。在制药工业中包埋法应用较多,其次是吸附法。由于底物和产物性质、酶的性能反应特点及所有反应器类型的差异,要采用不同物理形状的生物催化剂。目前已用的生物催化剂有酶膜
8、、酶片、酶块、酶纤维、酶珠、酶管和酶微囊等形状。固定化细胞包括微生物细胞、动物细胞和植物细胞,目前更多地注重活细胞和增殖细胞的固定化。利用固定化细胞可进行但酶催化反应、多酶催化反应,还可以进行细胞的生长与繁殖,从而制造各种复杂的生化物质。植物细胞固定化大多采用包埋法,处于静止生长期的植物细胞用琼脂、琼脂糖、海藻酸钙或角叉菜胶固定,可获得较高活力的酶制剂。也可用聚氨酯、尼龙或聚丙烯酰胺在有细胞存在时聚合成胶。通常细胞以低密度包埋在颗粒中,经培养成高密度和组织化,创造一定梯度的微环境。如海藻钙包埋的常青花细胞(Catharauthus roseus)不仅可从色胺和开环马钱子碱合成西萝芙木碱,还能从
9、蔗糖经多步酶反应合成西萝芙木碱和蛇根碱;聚氨酯包埋的辣椒细胞合成的辣椒素比游离细胞多2-3个数量级,至今已报道了固定化南洋金花、烟草、胡萝卜等十多种细胞的研究,固定化植物细胞生产生物碱和色素的应用研究尚处于初级阶段。植物细胞固定化技术在进行中药有效成分的生产应用的研究有更好的前景。动物细胞形态大,无细胞壁,成倍时间长,细胞密度、产物浓度和生产率都远低于微生物,只有吸附和包埋法得以成功。目前动物细胞微囊化法用得最多的是聚赖氨酸/海藻酸(PLL/ALG)法,细胞生长密度可达108109。微囊化细胞主要有两方面的应用:培养微囊化动物细胞生产一些药物;作为药物直接用于治疗或作为药物筛选之用。如用来生产
10、单克隆抗体、干扰素、组织纤溶酶原激活剂TPA、白细胞介素、胰岛素生长因子和乙肝病毒表面抗原等。未来将有一大批具有生物活性的蛋白质可依赖固定化细胞在生物体外大规模的合成。1.2固定化酶反应器现代酶工程中,用于转化反应的核心设备称酶反应器。目前医药工业应用的固定化酶反应器型号、规格及种类较多,依进出料方式可分为批量反应器(BSTR)和连续液流反应器(CFTR)。BSTR简单,有单层与多层之分;CFTR有连续搅拌罐(CSTR)及填充床反应器(PFR)两大类。膜反应器(MR)属于PFR;搅拌罐-超滤组合反应器(CSTR-UF)和循环反应器(RCR)是CSTR衍生形式。流化床反应器(FBR)又是CSTR
11、与PFR组合形式。在选择反应器时,除考虑固定酶形状和稳定性、底物和产物性质及载体性质外,还要考虑生产成本、操作方式和反应器应用可塑性等因素。生产量小时选用BSTR;产量大时,为实现自动控制和连续化生产,选择连续流反应器;底物或产物为大分子,溶液黏度大而反应过程需控制温度和pH值时,选择CSTR;当底物溶液黏度大且所用催化剂为酶粉时,选择FBR最佳。反应器的选择应根据经验和具体实验数据而决定。生产时必须确定最佳反应条件,常以定容产率、转化率和产物浓度作为衡量反应条件的指标。欲求最佳转化效果,反应过程需考虑温度、时间、pH值、离子种类及强度、底物及产物浓度和酶活力等综合因素。1.3基因工程菌(细胞
12、)的固定化 生物细胞合成的酶量由于机体生命活动平衡调节的需要,一般不会表达出很高的浓度,从而限制了直接利用天然酶来解决更多化学反应的可能性,基因工程技术的进展和实用为此开辟了有效途径。应用基因重组技术将生物细胞中存在的极少的催化某一生化反应的酶通过基因扩增和增强表达,建立高效表达特定酶制剂的基因工程菌或基因工程细胞,从而进一步构建成固定化工程菌或固定化工程细胞的新一代催化剂。如德国BM公司应用蛋白质工程技术对表达青霉素酰化的基因进行点突变改造,重建了青霉素酰化酶工程菌,从而大大延长了固定化青霉素酰化酶的使用半衰期,其酶柱可连续使用700天以上2。应用DAN重组技术建立了丝氨酸和色氨酸合成酶工程
13、菌,这种工程菌组装的生物反应器可以用甘氨酸和甲醛为原料制造丝氨酸,再从丝氨酸与吲哚转化生成色氨酸,反应液中色氨酸浓度可达200g/L3。应用PCR法从E.Coli K12中克隆苯丙氨酸转氨酶基因,构建了生产苯丙氨酸的转氨酶工程菌,并展开了固定化研究和应用。1.4植物细胞培养产酶是20世纪80年代发展起来的新技术。首先选择适宜的植物外植体,经诱导、选育得到优良的植物细胞,再在人工控制条件的生物反应器中培养植物细胞,以生产色素、香精和药物等次级代谢物。植物细胞培养不受地理环境和气候条件等的影响,具有生产周期短、产率高等显著特点,已经发展成为生物工程研究和开发的重要领域。郭勇等人3先后进行了植物细胞
14、培养生产次级代谢物的研究,选育出了优良的木瓜细胞、大蒜细胞、鼠尾草细胞、玫瑰茄细胞、黄花蒿细胞、胡萝卜细胞、巴戟天细胞和银杏细胞等,分别用于生产木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等药用酶以及色素、药物等次级代谢物。超氧化物歧化酶 (Superoxide Dismutase,EC1.15.1.1 )简称SOD,是一种催化超氧负离子 (-2 )进行氧化还原反应,生成氧和双氧水的氧化还原酶 ,具有抗氧化、抗辐射和抗衰老的功效,是一种颇受关注的药用酶。目前SOD主要从动物血液中分离纯化得到,由于血液中含大量的杂蛋白,分离纯化工艺复杂,难以达到药用要求。从大蒜的外植体中诱导、选育得到
15、优良的大蒜细胞,再通过大蒜细胞培养进行SOD生物合成及其调节控制的研究4.结果表明:大蒜细胞的培养周期为15,培养得到的细胞中SOD的含量超过大蒜蒜瓣中SOD的含量,大蒜细胞中SOD的合成受水杨酸和甲基紫精等物质的诱导,低温胁迫作用也可促进SOD的生成,果胶酶等生物刺激剂可明显提高SOD的生成率。这些结果从理论上阐明了大蒜细胞SOD生物合成的调控机制,为大蒜细胞SOD的工业化生产打下了基础。木瓜凝乳蛋白酶 (Chymopapain)是木瓜乳中含有的一种具凝乳特性的蛋白酶,对腰椎间盘突出等骨质增生疾病有显著疗效,并可用于血型的检测、肿瘤的辅助治疗和消炎等。郭勇等人4在国内外首次采用植物细胞培养技
16、术,从木瓜的外植体中诱导、选育得到优良的木瓜细胞,经细胞培养生产木瓜凝乳蛋白酶。结果表明:细胞培养周期为 1 51 8,细胞中木瓜凝乳蛋白酶的含量超过木瓜果实中的含量,此成果为进一步的研究开发奠定了基础,该成果已申请中国发明专利。1.5酶的化学修饰酶的化学修饰是指利用化学手段将某些化学物质或基团结合到酶分子上,或将酶分子的某部分删除或置换,改变酶的理化性质,最终达到改变酶的催化性质的目的。随着基因工程、分子生物学、蛋白质工程、有机合成等技术的发展,酶的大分子物质化学修饰也发展起来,并且在修饰剂的选用和修饰方法上有较大进展。(1)修饰酶的功能基团如氨基、羟基、咪唑基等可离解基团;由此发展起来的酰
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