蛋白表达重组质粒构建是否遇到过如下问题.doc
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1、本实验源于一次失败的实验,从平板挑单菌落提取载体pET-32a(+),从EcoR和Hind 酶切位点插入PCR产物-PrP435。但由于单菌落所得载体pET-32a(+)在EcoR位点突变,由GAATTC突变为GAATTA(已测序),按第一章方法构建重组表达质粒PrP-pET-32a(+),在4连接过夜、TSS法转化E.coli DH5a未获成功。而将一周以后在4保存的连接液TSS法转化E.coliDH5 a却获成功。我们利用双引物primergenome进行菌落PCR筛选阳性克隆时发现,本应扩增出430 bp的DNA片断,实验结果却扩增出约1300 bp,860 bp,430 bp三个DNA
2、条带。消除所有污染因素后,结果依然是三个DNA条带。由此我们怀疑可能是PCR产物串联以后连入pET-32a(+)。根据以上现象我们对结果作如下探索:疑似串联重组质粒命名为PrPX-pET-32a(+),PrPX-pET-32a(+)转化E.coli BL21(DE3),进行表达鉴定;EcoR单酶切PrPX-pET-32a(+),琼脂糖凝胶回收,重新连接,试图获得单拷贝阳性克隆;用引物primervector进行菌落PCR鉴定;使用5primergenome单引物进行菌落PCR筛选鉴定; PrPX-pET-32a(+)和pET-32a(+)测序。试验结果表明:表达出49 KD蛋白,比单拷贝克隆表
3、达蛋白(35 KD)多15 KD,相当于2倍拷贝串联克隆表达蛋白大小。由于插入片段已突变出两个终止子,所以我们认为PrP435串联数应在2以上,前一拷贝应为反向插入,而后一拷贝应为正向插入。使用5primergenome单引物进行菌落PCR,试验结果扩增出约860 bp,420 bp,两个DNA片段,420 bp附近有稍大模糊条带,据此我们认为:串联数应在4以上。因为,由图3-5,使用5primergenome单引物进行菌落PCR时,上游因物在E1-E6处和PrPX-pET-32a(+)退火,下游引物在H1-H5处和PrPX-pET-32a(+)退火,上游因物带有EcoR酶切位点可以与载体上E
4、0产生错配。所以E1和H1之间可扩增出430 bp片段,E1和H5之间可扩增出约1300 bp片段,E1和E4之间可扩增出约860 bp片段。E1和3之间Taq酶同时往中间扩增,Taq酶要占一定的空间,就会使下游引物所加的Hind 酶切位点和三个保护性碱基消失一部分,扩增出约420 bp(比430 bp小)条带。其他各条带可同理推出。图3-5串联质粒PrPX-pET-32a(+)多克隆位点Fig.3-5 The MCS of cascade recombinant PrPX-pET-32a(+) sense strand , anti- sense strand , H Hind ,E Eco
5、R, vector本实验早期我们用EcoR单酶切PrPX-pET-32a(+),琼脂糖凝胶回收,并重新连接,试图获得单拷贝阳性克隆,但重复多次,经表达鉴定,未获成功。原因是EcoR位点突变(已测序)。以后重复该实验所用pET-32a(+)EcoR位点完好,EcoR单酶切PrPX-pET-32a(+),琼脂糖凝胶回收,重新连接,实验结果获得单拷贝阳性克隆。PrPX-pET-32a(+)经上海联合基因公司和上海基康基因公司测序均未获成功。原因可能是串联克隆造成的多个长回文序列,形成DNA的某种二级结构造成测序困难。虽本实验然重复出了失误实验的结果,表达出了相应的蛋白作,但也只是一次探索。建议对以下
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