蛋白质化学讲义.doc
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1、第二章 蛋白质化学要求掌握:氨基酸的种类;蛋白质的结构层次;蛋白质的重要性质;熟悉:氨基酸的重要化学性质;蛋白质分离纯化技术的基本原理。了解:蛋白质的分类;蛋白质的结构与功能的关系; 重点内容:氨基酸的种类;蛋白质的结构层次;蛋白质的变性、别构和两性性质。难点内容:肽键,蛋白质的空间结构。英文名:Protein 希腊语:roto,本义为“最原初 的”“第一重要的”有学者建议中文译为朊(ruan)蛋白质是一类重要的生物大分子第一节 概 述一、蛋白质的化学概念蛋白质是生命的物质基。氨基酸是蛋白质的基本组成单位。二、蛋白质的分类(一)根据分子形状:球状蛋白质 纤维状蛋白质(分子轴比小于10 (分子轴
2、比大于10)较易溶解,如血红蛋白) 可溶性 不溶性(如血纤维蛋白原) (角蛋白)(二)根据化学组成单纯蛋白质:仅由氨基酸组成结合蛋白质:蛋白部分+非蛋白部分核蛋白色蛋白糖蛋白脂蛋白磷蛋白(三)根据溶解度清蛋白:又称白蛋白,溶于水。精蛋白:溶于水及酸性溶液。组蛋白:溶于水及稀酸溶液。球蛋白:微溶于水和稀的中性盐。谷蛋白:不溶于水、醇和中性盐,溶于稀酸稀碱。醇溶蛋白:溶于7080%乙醇,不溶于水。硬蛋白:不可溶。(三)根据功能催化功能、调节功能、保护和支持功能、运输功能、储存和营养功能、收缩和运动功能、防御功能、识别功能、信息传递功能、基因表达调控功能、凝血功能、蛋白质的其他众多生理功能第二节 氨
3、基酸一、蛋白质的元素组成的显著特点-平均含氮量等于16%这是凯氏定氮法测定样品中蛋白质总含量的理论基础:蛋白质百分含量=氮百分含量X6.25注意: (1)所测为粗蛋白(2)不同样品中换算系数可不同二、氨基酸的种类(一)氨基酸的结构通式NH2R CO COOHH R表示侧链基团,R基不同则氨基酸不同。 氨基酸为两性电解质天然氨基酸有180多种,其中参与蛋白质组成的氨基酸称为蛋白质氨基酸。常见蛋白质氨基酸有二十种,这二十种氨基酸称为基本氨基酸其他称为非蛋白质氨基酸。(二)二十种基本氨基酸的分类和结构 -见P73表3-2除脯氨酸外,其他十九种基本氨基酸均为-氨基酸。除甘氨酸外,其他十九种基本氨基酸的
4、C 均为不对称碳原子,均具有旋光活性氨基酸的旋光异构体是依据与构型标准物-甘油醛的结构比较而确定的天然蛋白质氨基酸均为L-氨基酸;氨基酸构型与旋光方向无必然联系氨基酸的旋光方向和大小取决于它的R基性质,并与测定溶液的 pH有关,不同pH件氨基和羧基解离状态有关。(三)不常见的氨基酸-见P75表3-4三、氨基酸的物理性质1、溶解度2、旋光性3、极性四、氨基酸的化学性质(一)a-氨基参与的反应(1)与亚硝酸反应(2)与甲醛发生羟甲基化反应(3)酰化反应-P82(4)烃基化反应-见P82(二)a-羧基参与的反应(1)成盐反应(2)形成酯的反应(3)形成酰卤的反应(4)叠氮化反应(5)脱羧反应(三)a
5、-氨基和羧基共同参与的反应(1) 两性解离及等电点(3)与茚三酮反应(2)成肽反应(四)侧链基团的化学性质(1)巯基(-SH)的性质(2)羟基(-OH)的性质(3)咪唑基的性质五、氨基酸的分离分析(一)分配层析:支持剂是一些具有亲水性的不溶性物质,如纤维素、淀粉、硅胶等。滤纸层析:薄层层析:离子交换层析:阴离子交换树脂-N(CH3)3OH,阳离子交换树脂-SO3H电泳:(二)分离氨基酸的层析技术滤纸层析-根据溶解度原理是分配层析。一种溶质(如氨基酸)在互不相溶的两相溶剂中分配,达到平衡后,该溶质在两相溶剂中的浓度比值等于其在两相溶剂中的溶解度之比,该比值是一常数,称为分配系数。-见P73不同溶
6、剂构成层析系统的两相1、滤纸层析:支持介质:滤纸固定相:滤纸纤维吸附的水。极性侧连的氨基酸易溶于水而与固定相亲和,移动较慢。流动相:水饱和的有机溶剂,如丁醇-醋酸。非极性侧连的氨基酸易溶于有机溶剂而与流动相亲和,移动较快。滤纸层析图解 2、离子交换层析-根据电荷常用强酸型阳离子交换树脂SO32-Na2+ SO32-AA +氨基酸自动分析仪利用离子交换层析3、薄层层析-根据氨基酸 吸附性质支持物: 玻璃板固定相:硅胶粉或纤维素粉涂布的薄层流动相:有机溶剂氨基酸在硅胶等薄层上反复吸附与解吸附而得以分离。(三)氨基酸的制备和应用-P93目前氨基酸的合成方法有5种:1)直接发酵法;2)添加前体发酵法;
7、3)酶法;4)化学合成法;5)蛋白质水解提取法。通常将直接发酵法和添加前体发酵法统称为发酵法。(四)蛋白质水解-见P93 蛋白质和多肽是由氨基酸以酰胺键形式连接而成的线性大分子。 肽键与一般的酰胺键一样可以被酸碱或蛋白酶催化水解。酸或碱能够将多肽完全水解,酶水解一般是部分水解.1、酸水解:常用6 mol/L的盐酸或4 mol/L的硫酸在105-110条件下进行水解,反应时间约20小时。此法优点:不容易引起水解产物的消旋化。缺点:色氨酸被沸酸完全破坏;含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有一小部分被分解;门冬酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成了羧基。2、碱水解一般用5 mol/L氢氧化钠煮沸10-2
8、0小时。碱水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏,产率不高。部分的水解产物发生消旋化。该法的优点是色氨酸在水解中不受破坏。3、酶水解目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶(proteolytic enzyme)或称蛋白酶(proteinase)已有十多种。酶水解多肽不破坏氨基酸,也不发生消旋化。水解的产物为较小的肽段。 第三节蛋白质的分子结构一、 肽键和肽肽键(peptide bond)是蛋白质分子中的主要共价键,性质比较稳定。它虽是单键,但具有部分双键的性质,难以自由旋转而有一定的刚性,因此形成肽键平面(图23),则包括连接肽键两端的CO、和2个C共6个原子的空间位置处在一个相对接近的平面上,
9、而相邻2个氨基酸的侧链R又形成反式构型,从而形成肽键与肽链复杂的空间结构。肽(peptide)是氨基酸通过肽键相连的化合物,蛋白质不完全水解的产物也是肽。肽按其组成的氨基酸数目为2个、3个和4个等不同而分别称为二肽、三肽和四肽等,一般含10个以下氨基酸组成的称寡肽(oligopeptide),由10个以上氨基酸组成的称多肽(polypeptide),它们都简称为肽。肽链中的氨基酸已不是游离的氨基酸分子,因为其氨基和羧基在生成肽键中都被结合掉了,因此多肽和蛋白质分子中的氨基酸均称为氨基酸残基(amino acid residue)。多肽有开链肽和环状肽。在人体内主要是开链肽。开链肽具有一个游离的
10、氨基末端和一个游离的羧基末端,分别保留有游离的氨基和羧基,故又称为多肽链的N端(氨基端)和C端(羧基端),书写时一般将N端写在分子的左边,并用(H)表示,并以此开始对多肽分子中的氨基酸残基依次编号,而将肽链的C端写在分子的右边,并用(OH)来表示。目前已有约20万种多肽和蛋白质分子中的肽段的氨基酸组成和排列顺序被测定了出来,其中不少是与医学关系密切的多肽,分别具有重要的生理功能或药理作用。多肽在体内具有广泛的分布与重要的生理功能。其中谷胱甘肽在红细胞中含量丰富,具有保护细胞膜结构及使细胞内酶蛋白处于还原、活性状态的功能。而在各种多肽中,谷胱甘肽的结构比较特殊,分子中谷氨酸是以其羧基与半胱氨酸的
11、氨基脱水缩合生成肽键的,且它在细胞中可进行可逆的氧化还原反应,因此有还原型与氧化型两种谷胱甘肽。近年来一些具有强大生物活性的多肽分子不断地被发现与鉴定,它们大多具有重要的生理功能或药理作用,又如一些“脑肽”与机体的学习记忆、睡眠、食欲和行为都有密切关系,这增加了人们对多肽重要性的认识,多肽也已成为生物化学中引人瞩目的研究领域之一。多肽和蛋白质的区别,一方面是多肽中氨基酸残基数较蛋白质少,一般少于50个,而蛋白质大多由100个以上氨基酸残基组成,但它们之间在数量上也没有严格的分界线,除分子量外,现在还认为多肽一般没有严密并相对稳定的空间结构,即其空间结构比较易变具有可塑性,而蛋白质分子则具有相对
12、严密、比较稳定的空间结构,这也是蛋白质发挥生理功能的基础,因此一般将胰岛素划归为蛋白质。但有些书上也还不严格地称胰岛素为多肽,因其分子量较小。但多肽和蛋白质都是氨基酸的多聚缩合物,而多肽也是蛋白质不完全水解的产物。二、 蛋白质分子结构及其规律性蛋白质是大分子化合物,一般由一条肽链、上百个氨基酸,即成千上万个原子组成,分为一、二、三、四4级、四个不同的层次(表25),以便进行深入研究,其中二、三、四级均属于蛋白质的三维空间结构(three-dimensional structure,3D)或构象(conformation)。随着研究的深入,现在在蛋白质二级和三级结构之间,又增加了一些超二级结构和
13、结构域(domain)。(一) 蛋白质的一级结构(primary structure)蛋白质的一级结构,专指多肽链中氨基酸(残基)的排列的序列(sequence)。若蛋白质分子中含有二硫键,一级结构也包括生成二硫键的半胱氨酸残基位置。一级结构就是指蛋白质分子中由共价肽键相连的基本分子结构。不同的蛋白质,首先具有不同的一级结构,因此一级结构是区别不同蛋白质最基本、最重要的标志之一。蛋白质一级结构的重要性,首先是由于其序列中不同氨基酸侧链R的大小、性质不同,决定着肽链折叠盘曲形成不同的空间结构和功能。同时由于蛋白质的一级结构是由遗传物质DNA分子上相应核苷酸序列、即遗传密码决定的,蛋白质与DNA分
14、子均为线状,因此具有“共线性”关系,不同生物具有不同的遗传特征,首先是由于其不同的DNA,编码合成出不同的蛋白质,具有不同的一级结构所决定的,因此蛋白质一级结构的认识对阐明其众多生理功能之分子本质甚为重要。蛋白质分子中氨基酸序列自动分析仪的问世,使蛋白质一级结构的测定有了飞速的发展。同时由于DNA分子中核苷酸序列的测定也有了迅猛的发展,且其步骤较蛋白质序列测定方法更快速简便,因此近年来更有通过蛋白质相应基因DNA序列的测定,来推断该蛋白质的一级结构。自然界亿万种不同的蛋白质,首先是由于它们有亿万种不同的一级结构,这是其不同空间结构与生理功能的分子基础。(二) 蛋白质的二级结构(secondar
15、y structure)蛋白质的二级结构是指多肽链中相邻氨基酸残基形成的局部肽链空间结构,是其主链原子的局部空间排布。蛋白质分子的空间结构有一些共同的规律可遵循,其中二级结构主要是周期性出现的有规则的-螺旋、-片层、-转角、-螺旋和无规则线圈等几种二级结构单元,且这些有序的二级结构单元,主要是靠氢键等非共价键来维持其空间结构的相对稳定的。1. -螺旋(-helix):是蛋白质分子中最稳定的二级结构,其基本特征是:(1) 肽链骨架由肽键上的C、N原子与氨基酸残基中的碳原子组成,交替形成了肽链主链,它从N端到C端为顺时针方向的右手螺旋结构(图2-6、2-7)。(2) 螺旋每圈由3.6个氨基酸残基组
16、成,每圈上下螺距为0.54nm(5.4)。相邻螺旋之间,由第1个氨基酸肽键上CO,隔三个氨基酸残基,与第5个氨基酸肽键上NH形成氢键,其间包括13个原子(图2-8),故又称3.613螺旋,且氢键方向与螺旋长轴基本平行,每相邻螺旋间有三个氢键维持其空间结构的相对稳定。(3) -螺旋类似实心棒状,氨基酸残基侧链R在螺旋外侧。各种蛋白质分子中-螺旋中氨基酸占总氨基酸组成的比例各不相同,如角蛋白中几乎全是由-螺旋组成,而小分子蛋白质尤其是在多肽中几乎无-螺旋的存在。-螺旋对维持蛋白质分子空间结构的相对稳定起着十分重要的作用。2. -片层结构(-pleated sheet structure)又称-折叠
17、,是肽链中比较伸展的空间结构,其中肽键平面接近平行、但略呈锯齿状或扇形。-片层可由25个肽段片层之间经CO与NH间形成的氢键来维系,但氢键方向与肽链长轴方向相垂直(图29),且反平行方式排列在热力学上最为稳定。大多数球状蛋白质分子中,-螺旋与-片层结构都同时存在,且是各种蛋白质分子中的主要二级结构,但各占氨基酸组成的比例不同,如表26所示。胰岛素分子中约有14%的氨基酸残基组成-片层结构,而胰糜蛋白酶分子中约有45%氨基酸残基组成-片层二级结构,-片层二级结构的可塑性比较大。3. 转角(turn,T),指肽链出现180左右转向回折时的“U”形有规律的二级结构单元,空间结构靠第1个氨基酸残基上的
18、CO隔两个氨基酸残基与第4个氨基酸残基上的NH形成的氢键来维持其稳定,氢键中包括1012个原子,因此较-螺旋卷曲得更紧密。-转角还有几种亚型,在球状蛋白质中含量丰富,且大多存在于球状蛋白质分子的表面,因此为蛋白质生物活性的重要空间结构部位。4. -螺旋(-helix):主要存在于胶原蛋白分子中,肽链以4.4个氨基酸残基盘旋一圈,靠与螺旋长轴基本平行的氢键维持螺旋的稳定,氢键跨18个原子,故又称4.418螺旋。它是比-螺旋稍大而疏松的左手螺旋。在胶原蛋白分子中,三股左手螺旋再盘曲形成稳定的右手超螺旋,进一步缩合形成胶原微纤维。5. 随意卷曲(randon coil):又称无规律卷曲,是指各种蛋白
19、质分子中彼此各不相同、没有共同规律可遵循的那些肽段空间结构,它是蛋白质分子中一系列无序构象的总称,也可以说是各种蛋白质分子中的特征性二级结构。因为在蛋白质分子中,并不是所有肽段都形成有序的-螺旋、-片层、-转角等二级结构的,而是有相当部分的肽段,其二级结构在各蛋白质分子间彼此并不相似,无共同规律可遵循,它也普遍存在于各种天然蛋白质分子中,同时也是蛋白质分子结构和功能的重要组成部分。蛋白质二级结构、乃至更高层次空间结构的形成,决定于其一级结构。由于一级结构中氨基酸残基侧链R大小与性质的不同,使肽键可形成不同的-螺旋、-片层等二级结构。如一段肽段由相邻较多酸性氨基酸组成,由于侧链R解离带了相同的负
20、电荷,因此就同性相斥而不易形成稳定的-螺旋;又如一个肽段中集中了较多具有大侧链R的氨基酸,因空间位阻也不易形成有序的-螺旋,而多形成随意卷曲。而胶原蛋白分子中富含小分子的甘氨酸和脯氨酸、羟脯氨酸,空间位阻小,故易形成三股超螺旋,且由于脯氨酸、羟脯氨酸为亚氨基酸,在形成肽键后其氮原子上已无氢原子可形成氢键,因此-螺旋不稳定,也就进一步形成了三股超螺旋。6. 超二级结构(super secondary structure)和结构域:近年来随着蛋白质结构与功能研究的深入,发现不少蛋白质分子中的一些二级结构单元,往往有规则地聚集在一起形成全由-螺旋、全由-片层或-螺旋与-片层混合、均有的超二级结构基本
21、形式,具体说,形成相对稳定的、2和T等超二级结构(图212)又称模体(motif)或模序。具有调控作用的转录因子蛋白质中,就有2和T超二级结构存在。且单个或多个超二级结构,尚可进一步集结起来,形成在蛋白质分子空间结构中明显可区分的区域,称结构域(图213),它们分别又是蛋白质分子中的一个个功能单位,故不严格地又称之为功能域。蛋白质的结构域一般由40400个氨基酸残基组成。蛋白质超二级结构和结构域的重要性,还在于它们往往分别是由该蛋白质相应基因的DNA链上不同的外显子编码的。体内蛋白质生物合成时,甚至可将分布在不同染色体上的外显子,通过重组合成出含有不同结构域组成的蛋白质。但因含有一些相同的结构
22、域,因此就可生成一些具有相似功能的蛋白质,形成蛋白质家族(protein family),和合成特异性不同的各种免疫球蛋白分子等。又由于结构域仅是大分子蛋白质中的一个部分,相对较小,比较容易研究其结构和功能的关系,因此结构域已成为目前蛋白质结构、功能研究中的一个关注焦点与热门课题。(三) 蛋白质的三级结构(tertiary structure)蛋白质的三级结构是指整条多肽链中所有氨基酸残基,包括相距甚远的氨基酸残基主链和侧链所形成的全部分子结构。因此有些在一级结构上相距甚远的氨基酸残基,经肽链折叠在空间结构上可以非常接近。例如肌红蛋白是一条由153个氨基酸残基组成的肽链,分子中由八个肽段分别形
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