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1、材料与试剂实验材料每种鱼随机各取5条,均选取正常无病的个体。取样时用抄网迅速将鱼从水体中捞出,剪刀敲击头部致死后,将鱼置于灭菌塑料密封袋内,保存在冰盒中,3h内转移到实验室,12h内处理鱼样。鱼肠道的处理(l)在无菌操作台上进行鱼样处理,先用75%酒精擦拭鱼体表,用解剖剪沿肛门向上剪开;(2)肠道用无菌棉线分别结扎肠段,75%酒精擦拭消化道外壁,用镊子去除附着表面的脂肪;(3)剖开肠道后轻轻收集每尾鱼的内容物,混匀; -20保存待用;用磷酸盐缓冲液(pH7.2)轻柔漂洗试剂磷酸盐缓冲液(pH7.2) 琼脂糖 Tris平衡酚分析纯生化试剂和PCR 反应引物 Taq DNA 聚合酶、dN TP 等
2、分子生物学试剂DNA分子量标准(DL100和500) 蛋白酶K JM109感受态 pMD18一T 异丙基硫代半乳糖昔(IPTG) DNA酶 CTAB 方法 1 肠道细菌总DNA的提取 使用无菌的牙签将肠道划开,剥取里面的肠道糜烂物。收集5个个体的肠道糜烂物,混合后作为这种鱼的代表样品。采用QIAamPR DNA stoo I Mini Kit 试剂盒提取样本的总DNA。总DNA溶解于100微升超纯水中。 2 PCR DGGE分析 采用引物P2(5ATTACGAGGAGCAG3)扩增16S rRNA基因的V3区。25微升反应体系包括25微升的10*Buffer,2微升的25mmol/LdNTP混
3、合物,1 U TaqDNA聚合酶(TaKaRa,Japan),每种引物25pmol,1微升总DNA。 PCR反应程序如下:94变性 4min进入30个循环,循环为94 45s,55 45s,72 1min。最后是10min延伸。然后进行“Reconditioning PCR”。2次PCR中均采用超纯水作为阴性对照保证PCR过程中没有污染。PCR经过琼脂糖电泳检查后,使用Hoefer DyNA Quant 200 system确定DNA的浓度。DGGE指纹图谱的构建采用Bio Rad Dcode mutation detection system进行。丙烯酰胺凝胶浓度为8%,变性梯度为25%-5
4、5%(100%变性剂为7mol/L尿素和40%去离子甲酰胺),PCR产物的上样量为每个泳道约300ng。在200V、60条件下电泳160min。电泳后凝胶使用10 000倍稀释的SYBR Green I进行染色。最后使用UV Iphoto照相系统进行紫外照相。 样品前处理 将采集的 5组样品分别用1. 5 mL PBS (pH 7. 4 ,浓度0. 2 mol / L) 悬浮, 剧烈震荡5 min 后,1 000 r / min离心3次 ,每次5 min,收集上清,然后12000r/min离心5min,收集菌体沉淀,用1ml PBS悬浮沉淀,重复离心,直到上清液清澈为止;最后再用1ml PBS
5、悬浮收集到的沉淀,置于2ml Eppendorf管中 -20保存备用。总DNA的提取 (1) 在上述处理的样品中各加入 180 L TE 缓 冲液,再加入 50 mg / mL 的溶菌酶 20 L,混匀后置30 温育最少 15 min。( 2)12 000 r / min 离心 5min,收集已消化细胞壁 的细菌。( 3) 加入 200 L Buffer BTL 重悬细胞,加 25 L蛋白酶 K(15 mg / mL) ,加入玻璃珠,涡旋混匀,置于55 恒温水浴,每 20 30 min 涡 旋 振 荡 样 品 1 次。 裂解时间随细菌的种类及用量的不同而不同,但一 般在 1 h 之内就能消化完
6、全。(4) 加入 25 mg / mL 的 RNA 酶 A 5 L,并在室 温下放置 5 min。(5) 加 入 220 L Buffer BDL,涡 旋 混 匀,并 在65 下水浴 10 min。在加入 Buffer BDL 后可能会形 成小团的沉淀,并不会影响 DNA 的提取。(6) 加入 220 L 无水乙醇并充分地涡旋振荡。 (7) 把 Hibind 自 旋 柱 装 在 1 个 2 mL 收 集 管 上,把第 6 步 得 到 的 样 品 ( 包括可能形成的所有沉 淀) 全部转移到柱子内,10 000 g 离心 1min 以结合DNA,弃去流出液和收集管。(8) 把柱子装到 1 个新的
7、2 mL 收集管上,加入500 L HB,加入 700L DNA Wash Buffer( 已用无水 乙醇稀释) 于柱子中,10 000 g 离 心 1 min 以 洗 涤 柱子,弃去流出液,收集管再继续下一步使用;柱子 重 新 套 回 2 mL 收 集 管,加 入 700 L DNA Wash Buffer,10 000 g 离心 1 min 以洗涤柱子,弃去流出 液。(9) 柱子 重 新 套 回 2 mL 收 集 管,10 000 g 离心空柱 2 min 以 甩 干 柱 子; 这一步对确保下步中 得到最理想的洗脱条件是至关重要的。(10) 把 柱 子 套 在 1. 5 mL 离 心 管
8、中,加 入 100 L 65 预热的 TE( pH 8. 5 ) 至柱子的膜中央,室温 下放置 5 min。(11) 室温下,10 000 g 离心 1 min 从柱子上洗 脱出 DNA。PCR扩增凝胶电泳DGGE电泳凝胶制备(1)灌胶玻璃和垫条的处理:用洗洁液仔细清洗玻璃板,横擦竖擦3遍,并用自来水彻底冲洗然后用去离子水漂洗干净。操作时必须带手套,取板时握住板的边缘,以避免手上的油脂印在板的工作面上。(2)灌胶玻璃板的安装与封闭:将长板平放在桌上,将垫条放置于两侧,放上短玻璃板,对齐。参照Bio一Rad Dcode system说明书操作。(3)凝胶板的制备:用50TAE、40%丙稀酞胺/双
9、丙稀酞胺(37.5:l)配制分别加入高浓度变性剂和低浓度变性剂的8%聚丙烯酞胺凝胶,凝胶中TAE终浓度为1倍,以42g尿素和40mL甲酞胺为100%变性剂。将两种变性剂浓度的8%丙稀酞胺凝胶液分别吸入两个注射器,将两个注射器放在梯度形成器的正确位置,缓慢且匀速地转动轮子,以便形成线性梯度。直至灌满至玻璃板顶部。然后立即插入梳子待胶凝固。凝胶大小选用16cm16cm0.75mm。(4)凝胶老化:凝胶室温放置2h,取出梳子,用1TAE溶液冲洗凝胶孔格,以除去可能存在的未聚合的丙烯酞胺。电泳(l)预热缓冲液:配制7L1TAE缓冲液,上样前将缓冲液加热到60。(2)加样:取9L PCR纯化产物与1uL10loading buffer(TaKaRa)混合,注入到加样孔底部。(3)电泳:电泳温度为60,变性剂浓度以0-100%为最大区间,电压从120一200V,电泳时间4一8h,经过多次垂直电泳实验来选取最佳实验条件。(4)变性剂浓度梯度组成:变性剂浓度10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%甲酞胺(ml) 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40尿素(g) 4.2 8.4 12.6 16.8 21 25.2 29.4 33.6 37.8 423
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