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1、黄曲霉真菌的生长抑制和拮抗研究 经济学院 统计0901 14号 刘孟娟【摘要】:黄曲霉及其毒素危害巨大,是饲料食品中的主要污染源之一。乳酸菌作为益生菌,在食品防霉去毒的方法已获得应用,这是运用生物控制的一个成功范例;芽孢杆菌也已经可以从海洋生物中提取并应用于抑制黄曲霉真菌的生长;黑曲霉因为具有良好的分泌多种降解酶的能力,并且生产的酶制剂、有安全、可靠、不产生毒素的特点,是公认安全(GRAS)的微生物,也是科技工作者用生物控制方法来降解黄曲霉毒素的一种有效微生物。【关键词】:黄曲霉真菌 乳酸菌 芽孢杆菌 黑曲霉 生长抑制霉菌毒素污染造成全世界每年粮食的损失达数千亿美元,而黄曲霉毒素因其对人、畜肝
2、脏的剧烈损害而名列毒性之首,被列为极毒。黄曲霉菌( Aspergillus flavus) 产生的黄曲霉毒素( aflatoxin)是目前发现的毒性和致癌性最强的化学物质之一,被世界卫生组织认定为1A 级危险物( WHO,1993)。黄曲霉毒素( AFT) 主要是粮油食品上常出现的黄曲霉( Aspergilluflavas Link ) 和寄生曲( Aspergillus ParasiticasSpeave) 产生的种具活性的、有毒的次级代谢产物。黄曲霉可通过产生孢子进行传播,侵染植物、植物产品各种食品和饲料等。它对农作物的产量,人、兽和禽类的健康构成很大威胁。凡是含淀粉多的食品,如玉米、花生
3、、大豆、大米、小麦、面粉等最易受到黄曲霉及其毒素的污染,果仁类也常受污染。因此采取何种措施来预防黄曲霉的生长与产毒是根本措施。目前的防霉措施是利用良好的农业生产工艺从田间防霉,在收获与保藏中采取防霉措施,此方法涉及多个步骤,操作起来较困难。此外,也有用化学防霉剂,多为化学合成物质,人们对其长期应用的安全性尚存疑虑。因此,对黄曲霉及其毒素的生物防治,目前国内外的研究方向主要是利用植物提取物和微生物的次生代谢产物来获得具有抗菌或降解毒素特性的物质。研究发现,多种植物提取物,如山苍子精油、百里香油、海马齿香精油、玫瑰精油等对黄曲霉生长以及毒素的产生有较强抑制作用。目前发现能有效防治黄曲霉的微生物主要
4、有乳酸菌、芽孢杆菌黑曲霉以及柠檬醛等。1、乳酸菌对黄曲霉真菌的生长抑制作用从健康动物体内分离抗黄曲霉活性的乳杆菌,不仅能添加在饲料中,起到生物防霉的作用,并且能在动物体内定植,为进一步研究开发饲料生物防霉剂提供菌种资源。应用于发酵乳制品中的乳酸菌种类非常多,能够抑制黄曲霉生长的只是少数。国内外对乳酸菌抗真菌的研究起步较晚, 对乳酸菌抑制黄曲霉的研究主要集中在筛选对黄曲霉生长有抑制作用或能吸附黄曲霉毒素的乳酸菌菌种, 研究分析乳酸菌在生长过程中所产生的抗真菌代谢产物, 乳酸菌抑制黄曲霉毒素的合成, 以及结合或降解黄曲霉毒素的作用。在已知的研究中, 某些植物乳酸杆菌表现出很好的抗黄曲霉效果, 如L
5、avermicocca等( 2000) 研究发现, 植物乳酸杆菌菌株21B 在小麦面粉水解产物中培养后, 离心获得的上清液几乎能完全抑制包括黄曲霉FTDC3226 在内的十几种真菌的生长。筛选有抑制霉菌活性的乳酸杆菌, 其应用于动物的保健和治疗中可以带来可观的应用前景。乳酸杆菌抗霉菌活性的应用有很多途径, 比如将菌种添加到动物饲料中, 同时发挥乳酸杆菌代谢物保鲜及抗霉菌污染作用, 延长饲料的保存期;筛选容易在动物体内定植的抑霉菌乳酸杆菌, 使其在动物体内发挥抗病原菌繁殖和霉菌毒素吸收作用。马静等( 2003) 研究发现, 乳酸杆菌可以减少人体肠道对黄曲霉毒素吸收, 增加其排泄。依据这一点可以将
6、乳酸杆菌应用于霉菌毒素慢性中毒的预防和治疗。从动物粪样中筛选出对黄曲霉有较强抑制效果的两株乳酸杆菌, 并鉴定为植物乳酸杆菌, 为抗真菌乳酸杆菌在动物生产上的应用提供了菌种资源。乳酸杆菌全菌液的抑制效果比乳酸杆菌上清液更好,原因可能是:除乳酸杆菌全菌液中本身含乳酸和一些抑菌代谢产物形成抑菌现象外, 乳酸杆菌细胞在被接种到PDA 培养基中后与霉菌间产生了多因素拮抗作用,另外, 乳酸杆菌代谢过程中会产生大量的乳酸, 使环境中的pH值降低, 抑制黄曲霉生长。乳酸所形成的低pH 环境有降低黄曲霉孢子萌发率的作用, 但接种了乳酸杆菌的处理组表现出更明显的抑制作用。这说明,对黄曲霉孢子萌发抑制作用的产生不仅
7、在于低pH 环境的影响, 还有乳酸杆菌代谢产物和微生物间互相拮抗等多因素同作用的结果。2、芽孢杆菌抑制黄曲霉生长海洋巨大芽孢杆菌对黄曲霉菌丝延长有抑制作用;随着巨大芽孢杆菌菌数的增加, 黄曲霉孢子的萌发率显著降低孢子萌发程度显著减弱;高浓度细胞溶液对黄曲霉孢子萌发和菌丝延长也显著的抑制作用;由此可见海洋巨大芽孢杆菌是通过竞争性生长和产生某种次级代谢产物来抑制黄曲霉孢子的萌发和菌丝的延长。海洋巨大芽孢杆菌能极显著地抑制黄曲霉产黄曲霉毒素( P 0.01) , 抑制率可达50. 75% . 越来越多的研究表明, 黄曲霉的次级代谢产物( 包括黄曲霉毒素) 对黄曲霉的生长非常重要, 其中, 黄曲霉毒素
8、的合成与黄曲霉孢子形成有密切联系, 抑制黄曲霉毒素的产生, 往往也会抑制黄曲霉孢子的形成;因此, 认为海洋巨大芽孢杆菌通过抑制黄曲霉毒素等次级代谢产物的合成来抑制黄曲霉的生长; 同时这种抑制的产生是因为该株海洋巨大芽孢杆菌会抑制黄曲霉次级代谢产物调节基因和黄曲霉毒素合成基因的表达, 如L aeA、af lR 和af lS 等。下一步将继续深入研究该株海洋巨大芽孢杆菌对这些调节基因表达的影响, 以更准确、全面地阐明该株海洋巨大芽孢杆菌对黄曲霉生长和毒素合成影响的本质.3、黑曲霉对黄曲霉生长的抑制黑曲霉因为具有良好的分泌多种降解酶的能力,并且生产的酶制剂、有安全、可靠、不产生毒素的特点,是公认安全
9、(GRAS)的微生物4,也是科技工作者用生物控制方法来降解黄曲霉毒素的一种有效微生物。黑曲霉发酵产物的提取物能抑制黄曲霉生长并明显降低毒素合成量。提示N+ 注入后是黑曲霉分泌抑制黄曲霉生长及毒素合成基因可能发生重组,尤其是可能发生了抑制黄曲霉生长的弱化子被删除,而使抑制黄曲霉生长分泌的毒素基因表达能力得到提高。用黑曲霉突变株与黄曲霉菌株对峙培养在PDA 上,与对照组及未用黑曲霉突变株和产毒黄曲霉菌株分别单独培养在PDA 上相比,产毒黄曲霉生长的菌落稀疏并呈灰绿色,这充分表明黑曲霉突变株对黄曲霉生长产生抑制作用,且在两菌交界处,产毒黄曲霉菌被黑曲霉突变株侵染、缠绕等拮抗途径,与产毒黄曲霉单独培养
10、相比较,产毒黄曲霉和黑曲霉突变株混合培养时黄曲霉毒素的浓度降低了71%,最大荧光值也降低了71%,说明N+ 注入产生的黑曲霉突变株能降解黄曲霉毒素或阻止黄曲霉产毒。4、柠檬醛对黄曲霉生长的抑制柠檬醛是小分子单萜类芳香醛( 3, 7-二甲基辛二烯- 2, 6 -醛) , 有顺式( Cit ral-a) 和反式( Citr al-b)两种构型, 反式溶解度较顺式大; 前者比重0. 88, 后者0. 89.具有通过改变质膜电导率、 Na+ , K+ -AT Pase 活性、阻碍菌丝体对营养物质吸收利用; 通过损伤Mt 结构、破坏氧化还原系统、降低耗氧量和呼吸速率而抑制菌丝体的生长.因而其抗菌的分子机
11、理复杂多样, 为多途径的复合作用.柠檬醛能明显降低酶的活性,与Nomura 20 和Kashiway amagi 21 所提出柠檬醛能改变细菌质膜流动性而改变酶的活性相吻合. 与细菌相比, 尽管真菌类的细胞壁和质膜的结构成分不完全相同, 但柠檬醛能通过改变膜流动性而降低膜上酶蛋白的活性, 从而影响菌丝体对培养基中营养物质的吸收利用率。电导率的提高, 进一步证明细胞壁及质膜选择通透性降低和内容物的外渗, 黄曲霉细胞壁和质膜结构改变而呈疏松状态. 这与柠檬醛既有疏水端能与细胞壁和质膜的脂质结合, 又有亲水端( CHO) 与细胞壁及质膜蛋白上亲水基团结合而影响细胞壁和质膜上分子结构有关. 随着柠檬醛
12、浓度升高, 将导致水和低渗溶液进入菌丝体内,造成细胞膨胀, 细胞壁和质膜局部胀裂而使细胞内容物大量外渗, 最终使菌丝体或孢子受损伤而失去萌发力或死亡.柠檬醛能破坏菌丝体、孢子的细胞壁和质膜的结构, 并改变其选择通透性, 而影响对营养物质的吸收利用; 柠檬醛的渗入, 导致Mt 结构的变化和不规则增生, 使正常的氧化还原系统遭到破坏,并使其与三羧酸循环中有关酶类的活力减弱, 从而产生呼吸速率的降低, 减少能量的产生和对氧的利用; 通过降低胞液MDH 活性而减少还原力NADPH 的产生, 而还原力减小, 又不可逆地阻碍脂质、核酸等物质的合成; 通过对Mt 和核DNA 损伤,使菌丝体细胞死亡、孢子失去
13、萌发力而被杀死. 故该醛抗菌、杀菌分子机制是多方面的综合作用. 本文从细胞、亚细胞和分子水平初步讨论了该醛高效、广谱、低毒的抗菌性, 对改变柠檬醛仅作为香精的单一用途, 并使其走向医药和食品贮运有重要意义.与此同时, 也为寻找或合成新的抗真菌药物提供了理论依据.结语:乳酸菌、芽孢杆菌黑曲霉以及柠檬醛些微生物对黄曲霉真菌的生长都有着各自的抑制作用,并且这些抑制作用也是相当不错的,学者们做进一步的探索以减少黄曲霉素生长和黄曲霉毒素对人类身体的危害是势在必行的。【参考文献】:1、 唐雨蕊,倪学勤,曾东. 乳酸杆菌对黄曲霉生长抑制的研究.中国饲料2、 唐雨蕊,倪学勤,曾东. 乳酸菌对黄曲霉生长和产毒的抑制影响3、 施翠娥,蒋立科. 黑曲霉抗产毒黄曲霉作用的初步研究. 食品科学2009, Vol. 30, No. 03 2174、 孔青,刘奇正,于方塘,王秀丹,单世华. 1 株海洋芽孢杆菌抑制黄曲霉生长和毒素合成的研究. 浙江大学学报( 农业与生命科学版)5、 涂彩虹,秦文,胡欣洁,李素清.一株黄曲霉拮抗细菌的分离筛选及鉴定.食品工业科技6、 徐进,计融,杨宝兰,李志刚,罗雪云. 简单快速筛选抑制黄曲霉生长的乳酸菌的方法.卫生研究7、 曹冬梅,张洪英,何成华,景晟,张海彬. 弯曲乳酸杆菌HB02抑制黄曲霉生长及产毒. 南京农业大学学报 2008, 31 ( 3): 125-129
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