植化方法学1.ppt
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1、植化方法学,天然药物化学教研室 邱 峰 2003年 4月,植化方法学(一) (各种色谱的分离原理及操作方法),一、硅胶相关色谱 二、氧化铝相关色谱 三、聚酰胺柱色谱 四、葡聚糖凝胶柱色谱 五、大孔吸附柱色谱 六、离子交换柱色谱 七、反应薄层,一、硅胶相关色谱,1、硅胶的结构(SiO2.XH2O) 2、分离原理 吸附作用:氢键作用、偶极作用和静电作用等 吸附强度的大小取决于硅醇基类型、硅醇基数目(比表面积)、孔体积、平均孔径,OSiOSiOH,O,O,O,O,3、使用范围 由于硅胶的弱酸性、往往适合于分离黄酮、香豆素、蒽醌、萜、甾体等中性或弱酸性类化合物。,黄连生物碱的化学结构,薄层板: 硅胶G
2、薄层板, 110 C 活化1小时 展开剂: 乙酸乙酯-氯仿-甲醇-浓氨水-二乙胺 (8:2:2:1:0.5) 检测方式:UV366nm,黄连生物碱硅胶薄层层析图谱,4、常用硅胶的规格 100140目、100200目(75150m)、200300目(4575 m )为柱层析硅胶 1040m为薄层层析硅胶 210 m为高效薄层或液相色谱硅胶 5、薄层层析硅胶的种类 硅胶G:含有石膏1214%,粒度1040m,pH67(10%)。 硅胶H:不含石膏,pH67(10%)。 硅胶GF254:含有石膏1214%,pH67(10%),且含有少量的荧光剂。,6、硅胶含水量与活性之间的关系,细玻璃管法测定硅胶活
3、性 展开剂:苯,7、含水硅胶色谱 硅胶含水达17%以上为分配色谱,适宜分离生物碱、糖类、皂苷、有机酸等。表现在薄层和开放柱上,展开剂或洗脱剂为多相含水系统。,薄层板:硅胶H 展开剂: I: 正丁醇-乙酸乙酯-水 (4:1:1) II: 氯仿-甲醇-水 (65:35:10)下层 显色:10%硫酸,红参中人参皂苷的薄层色谱图,8、硅胶制备薄层 操作方法 1)、薄层的制备 2020cm2的玻璃板一般所用硅胶量为820g,5CMCNa的用量按1:22.5为宜,晾干,根据需要可进行活化。 2)、点样(1050mg) 用玻璃毛细管或移液管将样品溶液线形点样于硅胶板上,点样线宽度要适宜,过窄易超载,过宽影响
4、分离效果。 3)、展开 晾干点样处溶剂后,以选好的展开剂进行展开,对有些化合物预饱和一段时间,分离效果更好。,原点,前沿,4)、标记色带 取出薄层板,晾干,根据荧光画出色带,或部分显色确定色带的位置。 5)、剥离、提取 剥离色带部分的硅胶,以合适的溶剂直接提取或装入小玻璃柱进行洗脱。(忌用含水系统处理) 6)、浓缩 浓缩提取液或洗脱液得色带对应的化合物。多数情况下,需要进一步的精制或纯化处理。,8、制备薄层的操作,原点,前沿,制备薄层展开后的后处理,9、硅胶柱层析的操作(开放柱) 1)、拌样(干法上样): 将分离样品溶于易挥散溶剂中,与三倍量的柱层析硅胶拌样。滴加样品溶液的同时应不断搅拌均匀,
5、一旦达到制剂软材程度应停止滴加样品溶液,晾干或低温干燥(注意有毒溶剂的处理)后再继续操作,直到样品溶液全部加入。 2)、装柱: 将拌样硅胶1020倍量的柱层析硅胶浸泡于起始溶剂中,搅拌赶出气泡,装入准备好的玻璃柱中,平衡至不再下降为止。 3)、上样: 待硅胶柱平衡好后,将干燥好的拌样硅胶用漏斗加入柱子上部(加入前要保证起始溶剂在柱子中足够的高度以免带入气泡)。 4)、加入保护硅胶或棉花:用起始溶剂洗脱至柱中上端溶剂颜色变浅或无色为止,然后加入适量硅胶或棉花起缓冲作用。,5)、柱层析洗脱剂的选择 起始溶剂原则上对被分离样品中的任何物质都没有洗脱能力。洗脱溶剂的选择以硅胶薄层板的层析行为为指导,被
6、分离成分的Rf值一般在0.10.2为宜(理论上为0.20.3)。,“注”:展开剂和洗脱剂的选择最好参考文献资料。 6)、更换洗脱剂 在一个洗脱剂系统下,一般要求至少洗脱35个保留体积,实验中可根据具体情况决定是否更换,比如到5个保留体积还有较大量的的物质被洗脱下来,就应当继续洗脱下去。 7)、保留体积的估算 浸泡硅胶的溶剂量 + 空柱溶剂量洗脱下来的溶 剂量=保留体积 8)、流速的提高:柱上端加压或下段流出口减压,特别是填料硅胶粒度小时可采用这两种方式加快洗脱速度。 9)、合并相同流份:硅胶薄层指导合并,流份体积根据硅胶柱大小和分离样品量确定。,10、硅胶中低压柱色谱及高效液相色谱,1)、流动
7、相的选择: 通过硅胶薄层摸索液相色谱条件,最好用高效薄层指导来选择流动相,其粒度接近于中低压柱填料的粒度,用自制的硅胶薄层选择流动相时注意粒度和含有水分的影响。另外也可用同类型填料的分析柱摸索流动相条件。 2)、样品溶液的处理: 尽可能选择流动相溶解样品,并用微孔过滤器过滤。选择极性大于流动相的溶剂配制样品溶液会因进样量的不同影响保留时间和分离效果。 3)、检测器的选择: 有紫外吸收的物质尽可能用紫外检测器,无紫外吸收的或紫外吸收较弱的可选用示差 检测器。目前出现的蒸发光散射检测器则是对几乎所有的非挥发性天然化合物适用。,11、硅胶干柱法(适用于有颜色或荧光的物质分离) 干柱层析的优点: 1)
8、、分离效果比湿装柱高。 2)、洗脱液的选择可直接套用薄层层析的最佳分离 条件。 3)、常采用塑料薄膜柱,对有荧光或颜色的物质, 可借助紫外灯分割各色带,避免交叉。 4)、适用于制备性分离。 5)、设备简单,消耗溶剂少,节省时间。,硅胶干柱法的操作,1)、填充: 将硅胶填料(可用薄层层析硅胶)装入玻璃柱或透明塑料薄膜柱中,注意不要留有空隙。 2)、上样: 将拌样硅胶均匀地加入柱的上端,并在拌样硅胶的上方加入与柱内径相同大小的原形滤纸。 3)、展开: 将薄层展开剂条件直接用于干柱层析上,配好足量的展开剂用分液漏斗滴加入柱中,待展开剂渗透到柱子的下端,即停止滴加。,4)、分割: 根据色带或荧光带做好
9、标记,然后用弯勺取出各标记带对应的硅胶(玻璃柱),塑料薄膜柱可直接切割。 5)、洗脱: 用合适的溶剂提取色带或荧光带硅胶,也可装入小玻璃柱用溶剂洗脱下来。 “注意点”: a :上样量比正常的硅胶柱层析要少,一般1:1001:300; b :上柱硅胶的粒度越小效果越好,一般用与薄层规格同样的硅胶H,大的开放柱粒度要大些。,12、与硅胶相关的反相色谱填料,常用的反相填料有RP-18(ODS)、RP-8和RP-2,13、反相分离色谱柱操作上的注意点,1)、流动相为含水系统,同样可由相应的TLC确定柱层析的色谱条件,常用的有机溶剂有甲醇、乙腈、四氢呋喃。 2)、柱层析的填料最好以甲醇浸泡上柱,然后用甲
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