《细胞工程制药》PPT课件.ppt
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1、第三章 细胞工程制药,细胞工程药物 第一节、动物细胞工程制药基本技术及实例 第二节、植物细胞工程制药基本技术及实例,作业,一、名词解释:转化细胞系、微载体培养 、毛状根、气升式反应器 二、分别列出1种动物细胞、1种植物细胞工程制药的实例,细胞工程制药,指以细胞为研究对象,通过细胞培养获得自然界难以获得的珍贵产品的新兴生物技术。,微生物、动物、植物细胞培养特性,动物细胞工程药物,适合真核表达的的药物蛋白或亚单位疫苗 单克隆抗体 药物筛选模型,培养方法,(一)原代培养 1、组织块培养法 2、细胞单层培养法 (二)传代培养 (三)单细胞克隆培养,动物细胞培养概述,动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体
2、外人工培养条件下生长、增殖的过程。,培养细胞的分类,悬浮型血液、淋巴细胞、杂交瘤细胞 贴壁型: A上皮细胞型 B成纤维细胞型 C游走细胞型 D多形细胞形 (1)动物细胞贴壁生长特性 (2)动物细胞接触抑制特性 兼性贴壁型:,动物培养细胞的优点,(1) 细胞经培养后形成的细胞系和细胞株,特征均一。 (2) 理化环境可控制,培养物可直接被观测。 (3) 提供大量均一的细胞供制备用。 (4) 便于进行人工筛选。 (5) 结合显微电影技术,可观察细胞代谢活动和反应。 应用: (1)生产有重要价值的蛋白质产品 分泌性的蛋白质产品 (2)培养皮肤细胞用于移植 形成组织 (3)检测有毒物质 致癌致畸引起染色
3、体数目和结构改变 (4)理论研究 培养正常或异常细胞用于生理、病理、药理研究,(1)动物细胞贴壁生长特性,(2)动物细胞接触抑制特性,细胞从接种到长满底物表面后,由于细胞繁殖数量增多相互接触后,不再增加。,动物细胞培养所需仪器设备,实验室要求 (A)和缓冲间相连,缓冲间内备消毒服装和鞋,口罩等,入内换上。 (B)室内空气不流通,有适当的光线,清洁,干燥.万级。 (C)侧部可设传递窗,用于物品传递。 (D)有消毒用紫外线灯 (1)培养器具 (2)超净工作台 (3)CO2培养箱 (4)倒置显微镜 (5)纯化水装置,(1)培养器具,培养瓶,培养板,培养皿,(2)超净工作台,超净工作台的工作原理是利用
4、鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒,使空气得到净化。 100级超净工作台指标:(0.5m3.5粒/L),(3) CO2培养箱,CO2培养箱设定的条件为37 ,5CO2 。 二氧化碳的作用:细胞生长需要、维持pH值。,(4)倒置显微镜,(5)纯化水装置,培养细胞的生存环境,适宜的温度-人和哺乳动物培养细胞最适温度均为3537。 气体环境和氢离子浓度-需要一定量的O2和CO2(95空气+5% CO2);pH 7.2-7.4 营养物质-适当的培养基 环境无毒和无菌:双抗、消毒 渗透压:,平衡盐溶液(BSS),功效: 维持渗透压 提供缓冲系统 提供水分和无机盐,培养液要求,氨基酸-氮源 盐
5、类-钠离子,钾离子,镁离子,钙离子,氯离子,硫酸根离子,磷酸根离子,碳酸氢根离子等 葡萄糖:供能 缓冲系统-CO2缓冲系统或HEPES (羟乙基哌嗪乙硫磺酸 ) 生长因子-血小板源性生长因子(PDGF) ,表皮生长因子(EGF) ,成纤维 细胞生长因子(FGF)以及血管内皮生长因子(VEGF) 其它成分-维生素,矿物,有机补充物,激素等,动物细胞的培养基,动物细胞的培养基组成-氨基酸、葡萄糖、蛋白质、核酸类物质、维生素、辅酶、激素、生长因子、微量元素、缓冲系统。 1、天然培养基 2、合成培养基 3、无血清培养基,天然培养基,天然培养基如-血清,血浆,组织浸出液等 优点-营养成分丰富,培养效果好
6、 缺点-来源受限。成分复杂,影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染 天然培养基的类型: A乳蛋白水解物培养基 B酪蛋白水解物培养基 C血清及胚胎浸出液培养基,合成培养基,合成培养基-是根据细胞生存所需物质的种类和数量,用人工方法模拟合成的。如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 优点-标准化生产,组分和含量相对固定,成本低。 缺点-缺少某些成分,不能完全满足体外细胞生长需要。目前常用基本合成培养基血清来培养细胞 合成培养基的类型: (A)Eagle培养基(内含13种氨基酸、9种维生素、多种无机盐) (B)Ham氏F10培养基(内含20种氨基酸、多种维生素、
7、10种无机盐) (C)199培养基 (D)Waymouth氏MB752/1培养基 (E)NCTC109培养基,无血清培养基,无血清培养基-在基本合成培养基中加入起血清作用的种类激素和生长因子,如铁转运蛋白、乙醇胺、胰岛素、硒、氢化可的松、维生素C、促胃激素等等。 血清的成分: 激素:胰岛素、胰高血糖素、生长激素、孕酮、氢化可的松、雌二醇等 生长因子:表皮生长因子、神经生长因子、成纤维生长因子、血小板生长因子 结合蛋白:白蛋白、转铁蛋白等 贴壁和铺展因子物质:如纤维粘连素、多聚赖氨酸、胶原、血清铺展因子等。 多种金属离子 低分子量营养因子:维生素A、维生素C、脂肪酸等 不明成分,动物组织块培养法
8、,将动物组织切成直径为12mm的小块、并且进行培养的方法称为动物组织块培养法。有些动物组织如人的皮肤细胞,由于分散成细胞十分困难,因此常常采用组织块培养法。 动物组织块固着之后,加培养液,于37、CO2培养箱中、通入含5% CO2的空气进行培养,即可在组织块周围长出新的细胞单层。动物组织培养过程中,进行旋转或者振荡,培养效果更好。,动物细胞单层培养法,动物组织块经过胰蛋白酶消化分散成单细胞或者细胞团块之后,粘附于培养基中,培养成新生细胞单层的方法称为动物细胞单层培养法。 动物细胞单层培养法包括二个过程: 1、组织块分散成单细胞 2、培养,有关概念,细胞株:原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞
9、,大部分细胞衰老死亡,少数细胞存活到4050代,这种传代细胞为细胞株。 细胞系:细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态,只有部分细胞由于遗传物质的改变,使其在培养条件下可以无限制传代,这种传代细胞为细胞系。 细胞株和细胞系的区别: 细胞系的遗传物质改变,具有癌细胞的特点,失去接触抑制,容易传代培养。,动物组织,单个细胞,细胞悬液,贴壁生长,分瓶培养,10代细胞,50代细胞,不死细胞,原代培养,传代培养,胰蛋白酶,剪碎,加培养液,接触抑制,少数癌变,少数,动物细胞培养技术流程,为什么用胚胎组织或幼龄动物的组织细胞进行细胞培养,因为它们生命力旺盛,分裂能力强。(细胞分化程度低,增殖能力强,有丝
10、分裂旺盛,容易培养)。,为什么要将组织分散成了单个细胞再进行培养?,分散成单个细胞、细胞群(团)后容易培养, 细胞容易获得营养物质,其代谢废物容易排出; 分散成单个细胞培养,容易完成细胞水平的工程技术操作 。,为何要定期用胰蛋白酶使细胞从瓶壁上脱离下来?,当贴壁细胞生长到表面相互接触时,细胞就会停止分裂增殖细胞出现接触抑制。,哪些细胞失去了接触抑制?,传代培养时,少数超过50代的细胞,由于遗传物质发生改变,可无限增殖,并失去了接触抑制肿瘤细胞。,1、组织块分散成单细胞,消化分散组织块的方法分为三种: (1)酶消化法 (2)物理分散法 (3)酶消化与物理分散结合法,2、培养,上述细胞悬液经过计数
11、、稀释之后,接种于无菌培养器中,加入培养液于37条件下培养,细胞即粘于瓶底或者转瓶内壁,并且开始生长形成单层。 接种浓度: 上皮细胞1*1053*105个/毫升。 成纤维细胞2*1056*105个/毫升。 成体细胞应高于胚胎细胞。 培养时间: 上皮细胞57天形成单层。成纤维细胞34天形成单层。 培养条件: 动物细胞的需氧量较低,一般通入含5%CO2的空气进行供氧,有利于维持培养基的PH值。 培养方法 (1)原代培养 (2)传代培养,(1)原代培养,定义:从新鲜供体取得组织细胞后在体外进行首次培养,一般持续14周。 原代细胞:直接将动物组织和器官经过粉碎、消化而制得的悬浮细胞 步骤:取材-组织分
12、离原代细胞-培养,(2)传代培养,定义:当原代培养的细胞相互汇合时,细胞由原培养瓶消化、收集、稀释后传到新的培养瓶的过程。 注意:原代细胞类型不一,利用不同的消化时间和消化液。 细胞系-原代培养物首次传代成功后即成细胞系。 A有限细胞系:传代细胞系 B连续细胞系:转化细胞系,传代细胞系:又称二倍体细胞系,原代细胞经过传代、筛选、克隆等步骤,从多种细胞中纯化得到的某种具有一定特征的细胞系。 步骤: A贴壁细胞:去除培养基-胰蛋白酶消化-加入培养液,形成细胞悬液-稀释传代细胞系-培养 B悬浮细胞:收集细胞悬液-离心搜集细胞-用培养液稀释-稀释传代细胞系-培养 传代细胞: (1)具有二倍性染色体(2
13、n),染色体核型正常。 (2)具有明显的贴壁依赖、接触一致性 (3)培养条件下一般可联系传代50代,不能进行无限期的分裂繁殖。 (4)无致癌性。 目前已获得了多种人胚胎肺二倍体细胞,来源于3-4个月的胚胎肺组织,如: W1-38;MRC-5;MRC-9;IMR-90;2BS;KBM-13;LS-7,转化细胞系:正常细胞经过某个转化过程,失去正常细胞的特点而获得无限增殖能力的细胞系。 特征:原代细胞相比,其形态、染色体结构、倍增时间、营养要求、生理生化特性、病毒敏感性、抗原性、上均发生了变化,并且具有致癌性。 来源: 自然转化;人为转化;肿瘤组织 目前已经获得的确立细胞系有: ABHK-21细胞
14、 地鼠幼鼠肾脏 BHela细胞 人子宫癌细胞 CVero细胞 非洲绿猴肾脏细胞 DCHO细胞 中国仓鼠卵巢细胞 ENamalwa细胞 肯尼亚淋巴瘤病人,转化细胞系,单细胞分离培养,单细胞分离培养也称为细胞克隆培养,是指将单个细胞培养成纯细胞系群的技术。 由于动物细胞具有集群效应,单个细胞在培养基中难以生长。因此在克隆株培养过程中,常常采用: (1)使用条件培养基进行培养。 (2)在培养基中加入饲养细胞-如加入小鼠胸腺细胞和小鼠腹腔巨噬细胞。,单细胞微量板克隆技术,1、微量板克隆技术 2、单细胞微量板克隆技术的特点和应用,1、微量板克隆技术,微量板是指孔径为6mm,容量为0.3ml的多孔培养板。
15、常用的有96孔、55孔、24孔。 细胞克隆时,将细胞稀释成10个/毫升以下的悬浮液,然后向每1微孔中加入0.1毫升,则每1孔中的细胞数平均为1个。接种后在含5%CO2的空气的培养箱中进行培养,每隔48天更换一次新的培养液0.2ml,直到形成单克隆细胞株。 继代培养时,吸除培养液,用不含Ca、Mg的平衡盐溶液冲洗,再用胰蛋白酶进行消化,然后用培养液洗涤,再转移到25cm2表面的培养瓶中,加3ml培养液进行培养,几天后就会长成成片的新克隆细胞。,2、单细胞微量板克隆技术的特点和应用,微量板细胞克隆过程中,由于每一个克隆肯定来源于同一个细胞,其培养的重复性和可靠性均十分良好。 微量板细胞克隆技术可用
16、于建立纯细胞株、检查细胞遗传性的一致性,还可用于分离细胞变种。 微量板细胞克隆技术在评价药物、毒物对细胞生长的影响、筛选淋巴细胞杂交瘤工程、基因和细胞工程、制备单克隆抗体工程中具有重要作用。,动物细胞的种质保存技术,1、种质保存的必要性 (1)动物细胞在连续的继代培养中,容易污染和产生多种细胞混杂。 (2)细胞株在继代培养过程中常常发生变异。 (3)二倍体细胞存在寿命限制,无法进行大多的传代培养。 2、保存形式 (1)组织块 (2)细胞悬浮物 (3)细胞单层培养物 3、保存方法 4、超低温泠冻技术,3、保存方法,(1)常温法-将特定的动物细胞于20-30下进行保存的方法。 如人羊膜细胞单层于2
17、8下可保存1个月。 人肾细胞单层于25-30下可保存1个月以上。 人二倍体细胞单层可保存二周,中间换液则可保存30天以上, (2)低温法-将特定的动物细胞于4下进行保存的方法。 如人胚组织块于4下可保存1430天。 (3)超低温泠冻法-将特定的动物细胞于-70以下、或者在液氮中进行保存的方法。超低温泠冻法可以长期保存动物细胞,如二倍体细胞2BS自1973年来保存至今,其遗传性仍然没有变化。,4、超低温泠冻技术,(1)防冻剂准备 (2)超低温泠冻的具体方法 (3)超低温泠冻后的解冻方法,(1)防冻剂准备,超低温泠冻法需要使用防冻剂,以减少细胞在冻结过程中所受到的损伤。常用的防冻保护剂有:甘油、D
18、MSO。 A、甘油-毒性较小,能够结合水,减少组织结冰量,防止细胞内盐浓度升高,具有保护细胞的作用。其使用浓度一般为520%。 B、DMSO-是目前应用较多的一种保护剂,使用浓度为5-12.5%,与甘油相比,DMSO的毒性更低、抗冻能力更强。,(2)超低温泠冻的具体方法,先配制8-10%的DMSO + 15-20%的小牛血清 + 适量NaHCO3的保护液 将细胞培养物消化、分散、离心,收集单细胞 按5*106个/ml的浓度添加保护液,1ml/支分装于安瓿瓶中 0-4放置2-4小时 -20放置2-4小时 -702-4小时 在液氮中进行保存,(3)超低温泠冻后的解冻方法,将安瓿瓶取出,包裹4层纱布
19、浸入40水中,振摇融化40秒 混匀后立即接种到1-2瓶100ml的培养瓶中 按1-2-4-8ml的方式依次加入生长液。最终加至20ml。 注意事项 A、保护液中含DMSO时,可直接用来接种。 B、保护液含甘油时,应该离心除去甘油以防影响细胞增殖。,动物细胞融合技术,动物细胞融合技术-也称动物体细胞杂交技术,是指二个或者二个以上的动物细胞在外力作用下,合并为一个多核细胞的过程。 细胞膜蛋白质重新分布是细胞融合的基础。 (一)促融因素 (二)细胞之间的融合 (三)融合后杂种细胞的筛选技术,动物细胞融合,(一)促融因素,1、病毒诱导融合 2、PEG诱导融合 3、电场诱导融合 4、其它诱导融合 (1)
20、聚乙烯醇 (2)离心力,1、病毒诱导融合,某些不同种属的动物细胞在特定病毒、病毒外壳或者病毒碎片的作用下,可以发生融合作用。如仙台病毒、流感病毒、新城疫鸡瘟病毒、疱疹病毒等。 当二种不同的动物细胞混合物中存在大量病毒时,病毒或其组分会在细胞间起粘连作用而使细胞聚集成团,细胞膜上的蛋白质和脂质双分子层产生重排、进而结合成一个整体。 病毒所诱导的融合是随机的,无法人为控制,同时融合率较低。,为什么灭活的病毒能作为诱导剂?,因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布,细胞膜打开,细胞发生融合。,不灭活的病毒能作为诱导剂吗?,不能,因为不灭活的病毒会感染细胞。,2、PEG诱导融合,当二种
21、不同的动物细胞混合物中存在PEG时,就会产生细胞聚集作用。在除去PEG的过程中,即产生细胞融合现象。 所用的PEG分子量在1000-6000之间,一般浓度为40-50%,在37下作用2-3分钟,其促融效果最佳。 PEG促融合的作用机理不清,其促融作用也具有随机性,无法人为控制。,聚乙二醇(PEG)法,二种原生质体等量混合之后,加入聚乙二醇(PEG)进行融合。所使用的PEG分子量要求为1000-12000。再加入Ca、Mg。 最终浓度要求: PEG-30-40% MgCl2-20mmol CaCl2-50mmol PH=9.0 为了提高融合频度,同时可采用电诱导融合法、紫外线照射融合法。,聚乙二
22、醇法的步骤图示,融合液:含山梨醇或甘露醇,Ca2,K。 诱导液:融合液2045PEG 稀释液:含葡萄糖,NaOH,甘氨酸等。,3、电融合法,原理:在直流电脉冲的诱导下,原生质体质膜表面电荷发生改变,从而使原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂,进而连接闭合形成融合体。,电场诱导融合,将二种细胞混合物经过10-100V/cm的低强度非均匀交变电场作用时,细胞之间就会发生紧密接触,形成稳定的串珠状偶极子排列。在此基础上再对细胞实施瞬间高强度电脉冲就会发生膜击穿,不同细胞间通过膜脂质分子重排就能实现融合,形成一个双核或者多核的细胞。 一般来说,击穿电压为0.5-10KV/cm,作用时间为30-50微秒。 电
23、场诱导融合不损伤细胞,具有可人为操作的控制的特性,融合率较高。,电融合仪,(二)完整细胞之间的融合,取一定数量(107-108个/ml)的二种亲本细胞,充分混合 离心,取下层细胞悬液0.1ml 逐滴加入0.4ml、37、40%的PEG溶液,37静置90秒 缓慢加入5-10ml无血清培养液,摇晃4-5次,离心,除去上清液 每0.1ml细胞悬液加入25ml完全培养基,以每孔0.1ml分装于96孔培养板上。 37下CO2培养箱中培养。,动物细胞融合,动物细胞的融合还常常用到灭活的病毒作为诱导剂,单克隆抗体,由单个B淋巴细胞经过无性繁殖(克隆),形成基因型相同的细胞群,这一细胞群所产生的化学性质单一、
24、特异性强的抗体称为单克隆抗体。 特点:特异性强、灵敏度高,如何大量生产单克隆抗体?,利用淋巴细胞产生抗体的功能 利用肿瘤细胞无限增殖的特性 利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞 利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞,单克隆抗体制备过程,细胞融合、筛选,足够数量的、能产生特定抗体的细胞群,单克隆抗体,(三)融合后杂种细胞的筛选技术,筛选杂种细胞的目的是为了获得性能优良的杂合细胞。 1、杂种细胞的筛选原理 2、筛选系统,(三)融合后杂种细胞的筛选技术,筛选杂种细胞的目的是为了获得性能优良的杂合细胞。 1、杂种细胞的筛选原理 2、筛选系统,1、杂种细胞的筛选原
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