乙型肝炎病毒核苷(酸)类似物耐药的检测.ppt
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1、乙型肝炎病毒核苷(酸)类似物耐药的监测,缪晓辉 2009.5,一、HBV耐药的有关定义 二、各种耐药检测技术的评价 三、需要重视的几个问题,一、HBV耐药的有关定义,病毒学突破(virologic breakthrough) 病毒反跳(viral rebound) 生化学突破(biochemical breakthrough) HBV基因型耐药(genotypic resistance) HBV表型耐药(phenotypic resistance) 临床耐药(clinical resistance),HBV耐药的有关定义,病毒学突破(virologic breakthrough) 指在核苷类药
2、物治疗过程中,患者的血清HBV DNA水平一度被抑制,但在继续治疗中血清HBV DNA水平与最低值相比上升或超过1个log10(10倍)。,HBV耐药的有关定义,病毒反跳(viral rebound) 指核苷类药物治疗过程中患者的血清HBV DNA水平一度被抑制,但在继续治疗中血清HBV DNA升高至2104IU/mL或高于治疗前水平。,HBV耐药的有关定义,生化学突破(biochemical breakthrough) 指在核苷类药物治疗过程中血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平一度复常,但在继续治疗中血清ALT水平又再次升高。肝脏生活指标很多,但是在此仅指ALT。,HBV耐药的有关定义,HB
3、V基因型耐药(genotypic resistance) 指HBV基因组中的某些位点发生改变,导致这种药物对HBV的抑制作用下降或消失。这种HBV基因变异与HBV的耐药性有直接因果关系,通过这些变异位点的检测可判断HBV有无耐药性。,HBV耐药的有关定义,HBV表型耐药(phenotypic resistance) 通过体外细胞培养方法,直接测定HBV对某种药物的敏感性,或者在体外直接测定HBV聚合酶的活性,敏感性的降低或酶活性的下降均表明有耐药,即表型耐药。 通常以IC50来评估 IC505倍:敏感 IC50在510倍:部分耐药 IC50 10倍:耐药,HBV耐药的有关定义,临床耐药(cli
4、nical resistance) 指临床出现病毒复制不能被抑制,或HBV复制一度被抑制后又出现HBV DNA反跳,同时伴有ALT升高,或肝炎复发的其他临床证据。,二、各种耐药检测技术及评价,病毒学反跳或突破的监测 HBV基因型耐药监测 HBV表型耐药检测 临床耐药监测,病毒学反跳或突破的监测,基于对血清HBV DNA载量的动态监测 需重视以下三点: 1. HBV DNA载量检测手段的敏感性 2.检测技术的可靠性和稳定性 3.监测的间隔时间,HBV基因型耐药监测,时机 非必须 不主张常规、广泛应用,基因型耐药相关变异的命名,基因型耐药相关变异 在HBV多聚酶序列中的位置,HBV基因型耐药的主要
5、技术,碱基序列分析法 直接测序 克隆测序 聚合酶链式反应及限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP) 反向杂交分析技术(INNOLiPA) 基因芯片技术 实时荧光定量PCR技术 探针定点突变PCR技术 引物末端碱基定点突变扩增技术 熔解曲线法 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS),直接测序法,HBV YMDD变异直接测序结果图谱,直接DNA测序的局限性,1. 设备贵、技术高、耗材、费时。 2.必须有充足目的基因片段。 3.突变株比例小于20%时,由于竞争抑制作用不能被扩增。直接测序法检测HBV YMDD变异1.JPG,克隆测序法,克隆测序法,优点: 1.有助于发现混合
6、株并可大致确定不同序列毒株 之间的相对比。 2.提高了检测的灵敏度。 局限性: 1.技术难度较高。 2.检测周期更长。 3.检测的费用大大增加。,碱基变异可能导致: 原有位点消失 产生新的位点 识别位点移位,利用错配引物使 PCR产物中产生 特异的酶切位点,结果: 酶切片段长、短变化和多、少变化,聚合酶链式反应及限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP),限制性内切核酸酶的作用,它们能识别DNA的特异序列,并在识别序列内或其旁切割双链DNA。如:,Nde I限制酶的识别序列和切割位点:,-CA TATG- -GTAT AC-,Nla Ill限制酶的识别序列和切割位点:,-CATG NNN-
7、-GTAC NNN-,PCR-RFLP检测HBV YMDD变异,错配引物设计,PCR-RFLP检测HBV YMDD变异,PCR-RFLP检测HBV YMDD变异,PCR-RFLP技术的评价,优点: 简单、广泛易开展。 缺点: 1.限制性内切酶种类有限。 2.错配引物将导致退火温度降低、非特异条带增多。 3.引物非完全匹配,可能导致扩增效率降低、检测 敏感的下降。,反向杂交分析技术(INNOLiPA),INNOLiPA诊断HBV YMDD变异,DNA芯片技术,Scanner,microarray,“Hybridize”,arrayer,Microarray fabrication Sample
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