《《诊断酶学》PPT课件.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《《诊断酶学》PPT课件.ppt(132页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、第五章 诊 断 酶 学,第一节 概 述 一、酶的组成、结构和功能 1、酶的本质和特性 本质:蛋白质(绝大部分)或核酸(极少数),核酶: 核酸酶是唯一的非蛋白酶。它是一类特殊的RNA,能够催化RNA分子中的磷酸酯键的水解及其逆反应. 1982美国T.Cech和Altman于1989年共获诺贝尔化学奖。,酶的特性: 极高的催化效率、高度的特异性、催化的可调节性。,常用术语 酶促反应: 由酶所催化的反应 酶活性: 酶催化化学反应的能力 底物: 酶催化所作用的物质 产物: 酶促反应的生成物 酶的特异性:酶对作用物的选择性 激活剂: 加速酶促反应的物质 抑制剂: 减慢甚至终止酶促反应的物质,2、酶的结构
2、与功能 单纯酶:由约10010000个氨基酸肽键相连而成 酶 结合酶 蛋白质酶蛋白 辅酶 非蛋白部分辅因子 辅基,2、酶的结构与功能 酶是蛋白质,具有一、二、三、四级结构 单体酶:只由一条多肽链构成的酶 寡聚酶:由多个相同或不同亚基以非共价键连接的酶 多酶体系:在细胞内存在着许多由几种不同功能的酶 彼此聚合而成的多酶复合物,酶的活性中心 酶的必需基团在一级结构上可能相距很远,但在空间结构上彼此靠近,组成具有能与底物结合并起催化反应的特定空间结构区域,称为酶的活性中心。 对结合酶来说,辅酶或辅基参与酶活性中心的组成。,二、酶的催化作用机制 1、活化能 2、酶降低活化能的作用机制 酶通过与底物形成
3、一种或多种中间复合物来降低反应的活化能,三、酶的命名、分类与编号,一、血清酶的来源,根据酶的来源及其在血浆中发挥催化功能的情况,将其分为:,一般代谢酶 组织专一酶,血 清 酶,第二节 血 清 酶,1、血浆特异酶 主要指作为血浆蛋白的固有成分,在血浆中发挥特定的催化作用的酶,如凝血酶原。 2、非血浆特异酶 这类酶在血浆中浓度很低,并且在血浆中很少发挥催化作用。可分为: 外分泌酶 指来源于消化腺或其他外分泌腺的酶,如胰淀粉酶等。它们在血液中含量与相应的分泌腺的功能及疾病有关。, 细胞酶 指存在于各组织细胞中进行代谢的酶类。随着细胞的新陈代谢,有少量酶释入血液。其中大部分无器官专一性,只有小部分来源
4、于特定的组织,有器官专一性。这类酶细胞内外浓度差异悬殊,病理情况下极易升高,其下降的临床意义很少。这些酶最常用于临床诊断,如转氨酶、LD、CK等。,二、血清酶的去路 1、血清酶的半寿期 酶失活至原来活性一半时所需时间称为酶的半寿期。一般以半寿期来代表酶从血中清除的快慢。,血清酶甚至同工酶之间半寿期差别很大。这些有助于了解同一疾病不同酶升高持续时间的差异,半寿期长的酶,在血清中持续时间长。,2、血清酶的失活和排泄 研究表明酶主要是在血管内失活或分解的,酶的清除与血浆蛋白的清除途径并不完全相同。血清酶受蛋白酶水解而产生的低分子多肽或氨基酸可经小肠粘膜排至肠腔,再彻底分解成氨基酸后重吸收,其中大部分
5、氨基酸可被组织利用,不能利用的氨基酸可经尿排出体外。,三、血清酶变化的病理机制 正常情况下血清酶活性相对恒定。但在一些病理情况下,如细胞膜通透性增加或细胞坏死,细胞内酶合成增加,酶排泄障碍,恶性肿瘤异位分泌,酶合成障碍,中毒及遗传缺陷等,常导致血清中酶活性的改变。,三、血清酶变化的病理机制,(一)合成异常,合成减少,合成增多,(二)酶释放增加 酶从病变(或损伤)细胞中释放增加是疾病时大多数血清酶增高的主要机制。研究表明,炎症、缺血缺氧、能源供应缺乏、坏死和创伤等是细胞释放大分子酶蛋白的重要原因。细胞酶的释放量还受下述一些因素影响: 1细胞内外酶浓度的差异 2酶的相对分子量 3酶的组织分布 4酶
6、在细胞内的定位和存在形式,(三)酶排出异常 约有24的血清AMY由肾脏排出,肾功能减退时,血清AMY活性升高可能因酶排泄障碍而在血液中滞留所致。胆道梗阻时,血清ALP升高的原因是梗阻区ALP合成加强,ALP排泄受阻而逆流人血。但对于大多数酶而言,并不存在酶经肾脏或胆道排出异常而导致血清酶升高的这种清除机制。,四、血清酶的生理差异 1性别:多数血清酶的男女性别差异不大,但少数酶如CK、 ALP及-GT等有性别差异,男性高于女性。 2年龄:血清中有些酶的活性常随年龄而变化。最明显的一个 例子是ALP 3进食:血清中大多数酶不受进食的影响,故测定酶活性不一 定需要空腹采血。高脂、高糖饮食后血清ALP
7、活性升高。 4运动:激烈的肌肉运动可使血清中多种酶,如CK等活性升高。 5妊娠:妊娠胎盘组织可分泌一些酶进入母体血液,如耐热ALP、 LD等,引起血清中这些酶升高。 6其他:血清中有些酶与同工酶有种族差异.,第三节 酶促反应动力学 一、酶促反应 K1 K2 E + S ES E + P K-1 酶 底物 酶-底物复合物 酶 产物,反应级数及特征,一级反应:反应速率与反应物的浓度的一次方成正比。 二级反应:反应速率与两种物质浓度的乘积成正比。 零级反应:反应速率与反应物浓度无关而受它种因素影响而改变的反应。 混合级反应:,VmaxS VO = Km +S,米-曼氏方程,最大反应速率,底物浓度,米
8、氏常数,反应速度,(一)Km 若v=0.5Vmax,则Km=S,可见Km值等于酶促反应的初速率为最大速率Vmax一半时的底物浓度。Km值一般在10-610-2molL之间。Km只与酶的性质有关,而与酶的浓度无关。,VmaxS VO = Km +S,Km 意义: Km是酶的特征性常数之一,在临床酶学分析中具有重要意义。 11Km可近似地表示酶对底物的亲和力的大小,Km值越小,表示酶与底物的亲和力越大,反之亦然。 2如果一个酶有几种底物,则对每一种底物各有一个特定的Km值,其中Km值最小的底物大都是该酶的最适底物或天然底物。,VmaxS VO = Km +S,3如已知酶的Km,可计算某一底物浓度时
9、反应速率v和最大速率Vmax的比值,并可推知酶的活性中心被底物饱和的分数。同样,如要求v和Vmax有一定的百分比,也可算出所需底物浓度为其Km的多少倍。 4利用工具酶来测定体液中某一成分的浓度或某一酶的催化活性浓度时,可根据米-曼氏方程或其衍变方程式来计算工具酶的用量。 5测定Km值可鉴别不同来源但催化相同反应的酶是同一种酶或是同工酶。,VmaxS VO = Km +S,6如一个酶催化正逆两个方向,测定正逆两个方向底物的Km及底物浓度,可大体推测该酶在体内催化反应的方向及其催化效率。 7在代谢酶系中,当一组酶催化连续的代谢反应时,如已知各酶的Km及其相应底物的浓度,有助于寻找代谢的限速步骤。一
10、般Km值最大的酶所催化的反应为该酶系的限速步骤。,VmaxS VO = Km +S,(二)Vmax Vmax表示在一定酶量下的最大反应速率,即酶完全被底物饱和时的反应速度,与酶浓度 呈正比。在酶的浓度不变时,对于特定底物而言,Vmax也是一个常数。,(三)Km和Vmax的测定 将米曼氏方程进行倒数处理,而转换成直线方程为:,1max,0,1 , Km,1 o,斜率,双倒数作图法,三、酶促反应的影响因素 1、酶浓度 2、底物的种类和浓度 3、缓冲液的种类、离子强度和pH 4、温度 5、激活剂与抑制剂 6、其它,1、酶浓度 在S E时,酶促反应随酶浓度的增加而增加,即反应速率与酶的浓度成正比。 病
11、理情况下,酶浓度过高时,底物过早而且过多的被消耗,影响酶活性的测定,故需用生理盐水或其它缓冲液进行适当的稀释,但要注意稀释对测定结果的影响,如低酶浓度时,酶易解离为单体,常比多聚体更易失活。,2、底物的种类和浓度,一级反应,零级反应,一般选择Km最小 的最适底物,酶测定时底物浓度最好为Km的1020倍。,(三) 缓冲液的种类、离子强度和pH 酶与底物结合的能力,酶的催化活性,会受不同pH的影响,只有在最佳缓冲系统内才能充分表达。各种酶都具有使酶促反应速率最大时的pH,即最适pH。一般来说,动物酶多在6.58.0之间。但ACP反应的最适pH为4.07.0而ALP则为9.0 10.0。,最适pH并
12、非酶的特征性常数,易受缓冲液的种类、离子强度及底物浓度不同等因素影响。临床酶学测定时发现,用不同种类的缓冲液配制相同pH介质所测酶活性并不相同。缓冲液的离子强度也可影响酶的活性。必须强调的是,各种体液样品本身也是缓冲液,和底物混合后不一定维持原来pH,也会影响酶活性测定结果,所以应严格掌握测定样品与底物的用量比例,一般样品在总体积中的比例应不超过10。此外,缓冲液中的物质不应与分析系统中的任何物质反应,否则应特别加以说明。,(四)温度 酶促反应也有一个最适温度,在其两侧反应速率都比较低。在达到最适温度以前,温度每增加10,反应速率增加12倍。但温度对酶活性的影响具有双重性,一方面温度升高可加快
13、酶促反应;而另一方面温度可能使酶失活。,人体大多数酶的最适温度为37左右,超过42酶活性就逐渐降低,至60时酶因蛋白变性而失去活性。反之,酶在20以下时几乎无催化反应。酶的最适温度与底物浓度、pH、离子强度、保温时间等许多因素有关。,(五)激活剂与抑制剂 临床酶学测定中广泛应用金属离子等激活剂来提高测定的灵敏度。例如所有转磷酸的酶,如激酶类和ALP的反应都需要Mg2+的参加,如在反应体系中加入EDTA等螯合剂或以其为抗凝剂常抑制一些酶的活性。测定CK活性时,加入的激活剂有Mg2+和巯基,其中Mg2+是CK的辅基,含巯基的N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)使CK被激活。,抑制剂所产生的抑制作用分为
14、不可逆性与可逆性两类。前者抑制剂与酶共价结合,使酶活性丧失。后者抑制剂通过非共价键与酶可逆性结合。在设计和选择酶测定的方法时,应设法避免抑制剂对酶促反应的影响。,1. 竞争性抑制,E = Ef + ES + EI,作用特点 :Vmax不变,Km变大,Km随I的增加而增大,抑制分数与I成正比,与S成反比。通过增加底物浓度来消除或降低抑制剂的作用。,2. 混合性抑制,E = Ef + ES + EI + ESI,作用特点 :Vmax变小,Km不变, Vmax随I的增加而减小,抑制分数与I成正比,与S无关。不能通过增加底物浓度来消除或降低抑制剂的作用。,3、非竞争性抑制,4. 反竞争性抑制,E =
15、Ef + ES + ESI,作用特点 :Vmax 和Km都变小,并且Vmax和Km随I的增加而减小,抑制分数与I 和S成正比,,第 四 节 酶活性浓度的测定技术,酶活性浓度的测定技术,酶活性浓度概念 酶活性浓度测定 连续监测法检测酶活性浓度 工具酶 血清酶活性浓度测定条件的优化 酶活性浓度的单位,一、酶活性浓度的概念,1. 酶的特性:微量性、高效性等。,2. 酶促反应,E +,3. 酶活性浓度,即酶所催化的化学反应的反应速率,用酶促反应中单位时间内底物的减少量或产物的生成量来计算。,注意:只有当酶所催化的反应速度仅与 E 成正比,而不受其它因素影响时,即在酶促反应的零级期,才能根据酶所催化的化
16、学反应速率来确切表示酶活性浓度的大小。,实际上是通过检测酶活性浓度间接反映酶的量,因为直接检测酶的质量浓度要求的实验条件及技术条件非常高,价格昂贵,不适用于临床检测,因此测定酶活性浓度是临床酶学分析最为常见的方法,具有迅速、灵敏、成本低等特点。,但仅在上述前提下,只能在反应的零级期,即只有在酶促反应的最适条件下,才能真实地代表酶含量。因此可根据酶促反应进程曲线,采用合理的方法进行酶活性浓度的检测。,反应级数,时间,4. 酶促反应进程,延滞期,线性期,非线性期,Lag phase,Zero order,Linear phase,First order,酶促反应时间进程曲线,单试剂测定体系酶促反应
17、进程曲线,二、酶活性浓度测定方法,(一)按检测方法分类,1、量气法,其原理是通过测量一封闭反应系统中气体变化后的气体体积或压力,从而计算出气体的变化量,适用于测定在反应中产生或 消耗气体的酶,2、分光光度法,酶促反应的底物与产物结构不同,光吸收谱也有差异,不仅能在可见光范围测定有色溶液的浓度,还能在紫外光波长范围测定特异的带有双键或环状结构的无色物质,3、荧光法和放射性核素法,通过荧光光度计测定酶促反应生成荧光物质的速率,此速率与酶浓度成正比,4、其它方法,(二)按反应时间分类,1、定时法(取样法、终点法、两点法),定时法,早期测定酶活性浓度的方法,大多是使酶作用一段时间,然后加入强酸、强碱、
18、蛋白沉淀剂等终止酶促反应,测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量,计算酶促反应的平均速度。,连续监测法,即指连续测定酶促反应过程中某一产物或底物浓度随时间变化的多点数据,求出酶促反应初速度,间接计算出酶活性浓度的方法。其是临床测定酶活性浓度最常用方法。,2、连续监测法(动力学法、速率法),优点:,容易找到直线区域,选择线性反应期来计算酶活性,不需终止反应。,缺点:,线性反应期因酶种类和反应条件而异,必须用实验方法进行确定,必须选取酶促反应的最适反应条件,需要有可以连续监测的设备。,3、平衡法,目前临床应用较少,通过测定酶促反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度的总变化量来求出酶活性浓度的方法
19、。,三、连续监测法测定酶活性浓度,(一)种类,1.直接法,不终止酶促反应条件下,直接通过测定反应体系中底物或产物理化性质的变化(如:A、荧光、旋光性,pH、电导率、粘度等),从而计算出酶活性浓度。,评价,方法简单,但只有底物与产物之间,在理化性质方面有显著性差异时,才能使用直接法,只有很少一部分酶能用直接法测定。,(1) 目前以分光光度法最为广泛, 利用340nm处吸光度的变化测定各种脱氢酶。,340nm处A的变化可以反映反应体系中NAD(P)H量的增减,进而反映酶活性浓度。,(2) 利用一类人工合成的所谓色原性底物, 其本身为无色或微黄色,酶作用后生成有色化合物。,底物和测定对象:,(1)在
20、原反应体系中加入一些试剂,其只和酶反应物迅速作用,产生可被检出的物质,但该试剂不和酶反应,也不影响酶的活性。,+ 试剂,可被检出的物质,(2)酶偶联法 目前应用最多,即在原反应体系中加入另一些酶试剂,所进行的酶促反应和被测酶反应偶联起来。,(二)酶偶联反应,反应模式,被测酶,被测酶,始发反应,始发反应,指示反应,指示酶,指示反应,指示酶,辅助酶,辅助反应,酶偶联体系,辅助酶,辅助反应,1. 酶偶联反应时相,酶偶联反应一开始不能反映酶活性,在反应中存在几个时相。以临床常规酶学分析中常见的ALT的检测为例,在该酶偶联体系中的指示酶为脱氢酶,反应原理如下:,L-丙氨酸-酮戊二酸 -丙酮酸 L-谷氨酸
21、 -丙酮酸NADH 乳酸NAD+,ALT,LDH,此时反应的方向由NADH转变为NAD,随反应进行,A应随之而下降,通过检测反应产物A在340nm处A的变化速率,可以检测指示酶反应。,ALT双试剂法测定中,首先使血清与缺少-酮戊二酸的底物溶液混合,37C保温5m,将样品中所含的内源性-酮酸消耗完。然后再加入-酮戊二酸启动ALT催化的反应。,反应一开始加入的试剂1中只有丙氨酸,不存在-酮戊二酸,在此时相中,存在于样品中的干扰物质(内源性-酮酸)消耗完。,加入试剂2(即-酮戊二酸)启动反应,在初始阶段,产物-丙酮酸开始出现,并逐渐增多,但处于较低水平,指示酶反应速度也较低,不能代表待测酶的Vx。,
22、随着产物-丙酮酸增加到一定程度,Ex和Ei反应V相同,达到稳态期。此阶段340nm处A出现明显的线性变化。,最后由于底物的消耗,反应V逐渐减慢,偏离线性。,1酶偶联法,指示酶的反应系统:,以NAD(P)+或NAD(P)H为辅酶的脱氢酶类作为指示酶,监测其反应物NAD(P)H于340nm处紫外吸收或在紫外激发光365nm波长照射下,其在460nm发射强烈荧光的变化速率的测定系统 ; 是偶联过氧化氢(H2O2)以过氧化物酶(POD)为指示酶的测定系统。,Trinder反应:,2. 酶偶联反应注意事项,(1)延滞期应越短越好,测定时间要避开此期。 (2)不是所有的酶都适合用酶偶联法进行测定,酶偶联反
23、应V应超过或等于Vx,Ei反应必须是一级反应,即指示酶反应速率和测定酶的产物B浓度成正比。只有使用大量的Ei及其Km值很小时才能做到。 (3)从经济方面考虑应选用一些来源容易且价格便宜的酶(指示酶)制剂。 (4)适当的指示酶的用量,反复实验法确定,即做到酶偶联速率不随酶量的增加而升高,并在所选的最适条件下,指示酶偶联反应速率和酶活性浓度成正比。,(三)干扰因素,(1)其他酶和物质的干扰 (2)酶的污染 (3)非酶反应 (4)分析容器的污染 (5)沉淀形成,解决方法之一可通过试剂空白管检出并加以校正,另一个有效途径就是不用单一试剂而改用双试剂测定酶活性。,P151,五、血清酶活性浓度测定条件的优
24、化,方法 仪器设备 试剂 自动生物化学分析仪参数设置 标本的采集、运输与保存,标本的采集、运输与保存,溶血:细胞内酶而言,细胞内外浓度差异大;所以应及时进行分离,静脉采血后应在12h内分离血清。,抗凝剂:利用草酸盐、枸橼酸盐、EDTA抗凝的血浆一般不用作酶活性测定;肝素对ALT、AST、CK、LD、ACP检测均无影响,可用于急诊;临床多用血清为首选测定标本。,温度:大部分酶在低温中比较稳定,一般在血清分离当天测定,否则应放冰箱冷藏;通常在04 C下使用、处理及保存,除了一些冷变性的酶;液氮可作为酶学测定时血清标本及质控长期保存的方法。,P155,六、酶活性浓度单位,(一)酶活性单位,惯用单位,
25、用首先报告该种酶测定方法的临床酶学家的名字来命名其单位,即使同一种酶因方法不同而有数种活性单位,参考值差别很大。,国际单位,1963年,1IU1mol/min (25 C 及其他最适条件下) 1976年, 1U1mol/min(特定条件下) 1979年,1Katal1mol/s(规定条件下),1U16.67nKatal,例:碘色法测定血清淀粉酶(AMS),【单位定义】 1惯用单位:100ml血清AMS在3715min,水解5mg淀粉。,【操作】 测定管:稀释10倍后的血清0.2ml中加0.4g/L的淀粉溶液1ml37水浴7.5min后显色。 校准管(“对比”校准管):用蒸馏水替代血清,其它步骤
26、相同。 反应完成后,660nm处以蒸馏水调零,分别测出Au、Ac。 【计算】,测定管:血清0.1ml加底物液等后于37水浴15min,再加显色液显色。同时,设立除先不加血清、其它步骤相同的空白管(在反应最后加血清),510nm处以空白管调零测出Au。 校准管:以校准曲线中第2管为例。取0.05mg/ml的酚校准液0.4ml,加显色液等至总体积与测定管相等,用蒸馏水替代酚校准液、其它步骤相同的空白管调零,510nm处测出Ac。 【计算】,可见,第2管相当于酶活性单位为:20金氏单位/100ml血清,常简写为20金氏单位。,【单位定义】1金氏单位:100ml血清ALP在37与底物作用15min,产
27、生1mg酚。,【操作】,例: 金氏法测定血清ALP。,(二)酶活性浓度单位,以每单位体积所含的酶活性单位数表示;,各国学者习惯用U/L表示体液中酶催化活性浓度, 1U/L=16.67nKatal/L,正常上限(upper limits of normal,ULN)倍数,把酶测定值转换为正常上限值的倍数;,易于比较解释来自不同方法的结果,利于各实验室间质评调查;,可将ULN进一步适当分级,制定出轻度、中度及重度增加的范围,使检测结果更加一目了然;,(三)酶活性浓度计算,连续监测法检测酶活性浓度时,使用摩尔消光系数()。其定义为:特定条件下,一定波长的光,光径为1.0cm时,通过所含吸光物质的浓度
28、为1.00mol/L时的吸光度。,连续监测法测定在线性范围内每分钟吸光度的变化(A/min),自动生物化学分析仪测定同一酶,条件固定时,从理论上讲V,v和L均为固定值, 为常数,则可将公式简写为:,K为酶活性浓度定量系数 主要用于临床酶活性测定的计算与校正 K值设置应考虑酶的参考值上限及测定时间两方面,这些均与仪器测定的噪音有关。,第 五 节 酶的免疫化学测定,一、报告方式,酶活性浓度单位:U/L 质量浓度单位:ng/ml, g/L,二、优点,灵敏度高 特异性高 能用于检测一些不表现酶活性的酶蛋白 特别适用于同工酶的检测,样品中其他方法不易测出的少量或痕量酶,不受体液中其它物质的影响,酶原或去
29、辅基酶蛋白,三、缺点,要制备足够量多的提纯酶作为抗原和具有免疫化学性质的抗血清 步骤多,操作繁琐 测定成本高,第 六 节 同工酶及其亚型测定,一、概念,同工酶(isoenzyme),同一种属中由不同基因或等位基因所编码的多肽链单体、纯聚体或杂化体,具有相同的催化功能,但其分子组成、空间构象、理化性质、生物学性质以及器官分布和细胞内定位不同的一类酶。,亚型(isoform),即指基因在编码过程中由于翻译后修饰的差异所形成的多种形式的一类酶,往往在基因编码产物从细胞内释入血浆时因肽酶作用降解而形成。,二、分析方法,临床同工酶的分析可分为两步,首先精确地分离出某酶的各同工酶组分,测定酶的总活性和各同
30、工酶或亚型组分的活性,二、分析方法,(一)电泳法,原理,使用最为广泛 简便、快速、分离效果好、不破坏酶的天然构象 可分为:乙酸纤维素薄膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳及毛细管电泳 测定步骤为:区带分离、活性显色和检测结果,方法,同工酶氨基酸组成不同(一级结构不同),pI不同,电泳迁移率也就不同,电泳可将其分开。,显色染料,偶氮染料 四唑盐,离子型化合物,易溶于水,难溶于一般的有机试剂,利用其进行的偶合反应,生成不同颜色的偶氮色素进行同工酶谱检测,受氢体作用,四唑盐可被还原成紫红色的formazan,常用的有:NBT、INT、MTT等。其中NBT使用最多。,扫描定量,光密度计 荧光计,(
31、二)色谱法,柱色谱法,离子交换色谱 亲和色谱,商品化微型色谱柱,(三)免疫分析法,免疫抑制法 免疫沉淀法 其它免疫学方法,免疫电泳、RIA、EIA和CLIA,(四)动力学分析法,底物特异性分析法 抑制剂分析法 pH分析法 热失活分析法,三、同工酶检测意义,提高酶诊断的特异性 提高诊断的灵敏度 对某些疾病的预后有评价价值,有些同工酶有明显的组织分布和细胞内定位差异,有些同工酶的变化可在总酶变化之前发生,第七节 工具酶及其临床应用,工具酶:酶学分析中作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性浓度的酶。,指示酶和辅助酶作为反应系统中的试剂。,(一)工具酶,(二)常用工具酶,常用工具酶多为氧化还原酶类 工具酶
32、纯度不必要求过高 工具酶中杂质的含量有一定的限制,(三)工具酶参与的指示反应,临床生化检验中,很多项目的测定往往使用有工具酶参与的类似的反应原理共通(通用)反应途径。,1. 偶联H2O2的工具酶及其指示反应,葡萄糖 尿酸 胆固醇 甘油 丙酮酸,H2O2,(最常用),例:葡萄糖氧化酶法测定血清葡萄糖,GluO2H2O GAH2O2 H2O24-AAP酚 H2OO2红色醌类化合物,GOD,POD,葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD)利用O2和H2O将Glu氧化成GA,并释放H2O2 ,过氧化物酶(peroxidase,POD)在色原性氧受体存在时将H2O2分解为H2O和O2 ,并
33、将色原性氧受体4-AAP和酚去氢缩合为红色醌类化合物,即Trinder反应。红色醌类化合物的量与Glu含量成正比。,即POD催化下, H2O2氧化芳香族胺色素原生成有色色素,此类色素原供氢体包括:OT、DAB、ODA、TMB。,2. NAD(P)+或NAD(P)H偶联的脱氢酶及其指示反应,许多氧化还原反应,尤其是作为工具酶如LD、GLD、G6PD等参与时,常将底物的H去除后传递给NAD (P)+形成NAD(P)H。借助NAD(P)H340nm处特征性的光吸收,借此用分光光度法检测。,如:葡萄糖、尿素、-羟丁酸、甘油三酯、甲醇、血氨、 ALT、AST、LD、GLD、CK、ALD、G6PD、ICD
34、等。,例:,第 八节 临床常用血清酶分析,临床各系统疾病的酶学诊断,一、肝脏疾病,诊断肝实质细胞受损的酶:AST ALT LD(LD5),反映肝细胞合成功能的酶:ChE LCAT 凝血酶原,诊断肝纤维化的酶:MAO,诊断胆道梗阻的酶:ALP GGT 5-NT,二、骨骼及骨骼肌疾病,诊断骨骼疾病:ALP,诊断骨骼肌疾病:CK(CK- MM) AST LD (LD5),三、胰腺疾病,AMY LPS,四、前列腺疾病,ACP PSA,五、心肌酶谱,CK-MB:AMI诊断的金指标,ASTm:判断预后 LD:LD1LD2,一、转氨酶( Aminotransferases )及其同工酶,丙氨酸氨基转移酶 (
35、Alanine aminotransferases,ALT) / 谷丙转氨酶 GPT,天冬氨酸氨基转移酶 (Aspartate aminotransferases,AST/ 谷草转氨酶 GOT,1.催化反应,两种酶均需要磷酸吡哆醛(VitB6)为辅基,不含磷酸吡哆醛的酶蛋白为脱辅基酶蛋白,无催化活性。,ALT & AST,丙氨酸氨基转移酶 Alanine aminotransferase (ALT) 天门冬氨酸氨基转移酶 Aspartate aminotransferase (AST),ALT,80% AST,20% AST,ALT& AST,ALT、AST体内分布情况及半衰期变化,2.组织分
36、布,ALT大量存在于肝组织,其次为肾、心、骨骼肌等。其有两种活性同工酶,(ALTs)、(ALTm),分别存在细胞质及线粒体中。肝细胞中ALT大多存在细胞质,少量在线粒体,肝细胞坏死时血清中以ALTs为主。,AST存在多种器官,按含量多少为心、肝、骨骼肌和肾。其有两种同工酶ASTs、ASTm,分别存在细胞质及线粒体中。细胞轻度损伤ASTs显著升高,而严重损伤时ASTm 大量出现于血清中。血中AST升高多来自心脏或肝脏损伤。,ALT& AST,参考值范围 Reference interval: ALT: 5 - 40 U/L AST: 8 - 40 U/L ALT/AST 1,3.标本,溶血标本不
37、能用于检测 宜用血清,4 冰箱中可贮存1星期,活性无明显改变。,4.临床意义,ALT是反映肝损伤的一个灵敏指标,急性肝炎早期升高,ALTAST; 急性肝炎恢复指标 Deritis比值可用于肝炎诊断、鉴别诊断及判断转归 酶胆分离是肝细胞坏死先兆,AST主要用于肝脏疾病的诊断,AMI发病6-8h即升高,48-60h达高峰,4-5d恢复正常。由于AST在AMI时升高迟于CK,恢复早于LD,故目前诊断AMI价值不大。 急性肝炎,AST升高程度不及ALT;慢性肝炎,特别肝硬化、慢性活动性肝炎时,AST升高程度超过ALT。,ALT& AST,临 床 意 义 Clinical significance,N:
38、正常;:轻度升高; :明显升高;:降低,二、 -谷氨酰转移酶及其同工酶,-谷氨酰转移酶 ( - glutamyl transpeptid, - GT/GGT),1. 催化反应,又称:-谷氨酰转肽酶 ( -GTP/GGTP),一种含巯基的线粒体酶,可催化-谷氨酰基从GSH或其它含-谷氨酰基化合物中转移至另一肽或氨基酸分子上。,GSH氨基酸 -谷氨酰氨基酸半胱氨酰甘氨酸,GGT,2. 组织分布,肾脏中含量最多,其次为胰、肺、肝等。血清中的GGT主要来自肝胆。,3. 标本,GGT较稳定,室温下可放置2d, 4可存放1w, -20可储存1y;RBC中几乎无GGT,因此溶血标本可以检测。,参考值范围 :
39、 50U/L,4. 临床意义,有助肝胆疾病的鉴别诊断 与ALP联合进行肝脏疾病检测,胆道疾病,GGT阳性率高,而且升高明显,可高达5-30ULN,肝实质疾病是GGT一般只是中度升高,可达2-5ULN。,若ALP升高而GGT正常,则完全排除ALP的肝来源,若ALP和GGT都增加,则应先排除肝外引起GGT增加的原因,一旦排除,则GGT增高为肝病所致。,(1) 肝胆疾病检出阳性率最高的酶,(2) 用于判断恶性肿瘤有无肝转移,(3) 乙醇、巴比妥类药物等可诱导GGT的升高。,P168,三、 肌酸激酶及其同工酶和亚型,肌酸激酶 (creatine kinase,CK),1. 催化反应,CK催化肌酸和AT
40、P或磷酸肌酸和ADP之间的磷酸转移的可逆性反应,所产生的磷酸肌酸含高能磷酸键,是肌肉收缩时能量的直接来源。,2. 组织分布,广泛分布于全身,在骨骼肌含量最高,其次是心肌和脑。CK由两种不同亚基(M,B)组成的二聚体,细胞质中存在三种同工酶:CK-BB(CK1)、CK-MB(CK2)、CK-MM(CK3),线粒体中存在CK-Mt(CK4),其电泳速率最慢。 CK同工酶又可分为不同亚型,CK-MM有三种亚型,CK-MM1,CK-MM2,CK-MM3,电泳速率依次减慢;CK-MB有CK-MB2和CK-MB1两种亚型。,3. 标本,不得用溶血标本,RBC中含有AK,可干扰测定,引起测定值偏高;测定样品
41、宜用血清或肝素抗凝血浆,其它抗凝剂都抑制CK活性。,4. 临床意义,CK及其同工酶和亚型是目前临床上测定次数最多的酶之一,主要用于心肌、骨骼肌和脑疾患的诊断。,(1) AMI的早期诊断,(2) 全身疾病特别是肌肉疾病时,CK极度升高,四、乳酸脱氢酶及其同工酶和亚型,乳酸脱氢酶 (lactate dehydrogenase,LD/LDH),1. 催化反应,LD催化乳酸氧化成丙酮酸,同时将氢转移给辅酶而成为NADH,依条件不同而有可逆性。,2. 组织分布,LDH的亚基分为两类:骨骼肌型(M)、心肌型(H) 五种同工酶的亚基组成分别为: H H H H,H H H M,H H M M,H M M M
42、, M M M M,3. 标本,一般用血清,用血浆需离心去除血小板(血小板中含有大量的LD),采血后迅速分离血清;因RBC中LD含量比血清高100倍以上,不宜用溶血标本。 LD4、LD5宜冷变性,不应放在冰箱中,25 放2-3d,LD活性变化不大。,4. 临床意义,亚急性心肌梗死诊断有一定价值,但其特异性差;,(1) 诊断心脏疾病,心肌梗死和心肌炎时以LD1和LD2升高为主,大多数AMI患者血中会出现“反转比率”,即LD1LD2;,(2) 诊断肝脏疾病,肝细胞损伤时常出现LD5LD4;,急性肝炎时LD1LD2相对下降,LD5升高;慢性肝炎时LD5升高,且LD1LD3;,(3) 诊断骨骼肌疾病,
43、骨骼肌损伤时常出现LD5LD4;,五、碱性磷酸酶及其同工酶,碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase,ALP/AKP),1. 催化反应,一种含锌的糖蛋白,在碱性环境中(pH10.0)可以水解各种天然及人工合成的磷酸单酯化合物。,2. 组织分布,ALP广泛存在于各组织器官中,其含量以肝脏为最多,其次为肾、胎盘、小肠和骨骼等。血清中的ALP主要来自肝脏和骨骼。 生长期儿童血清内ALP主要来自成骨母细胞和生长中的骨软骨细胞,少量来自肝。,3. 标本,空腹采血,避免脂肪餐的影响;样品用血清,不能用明显溶血标本;在室温或冰箱放置,活性逐渐升高,可增加5-10,应在采血当日测定。,4. 临床
44、意义,很多骨骼疾病如变形性骨炎等患者血中ALP升高,我国常用于早期诊断佝偻病和软骨病。,(1) 诊断骨骼性疾病,(2)诊断肝胆系统疾病,尤其是黄疸,急性肝炎时ALP增高达2-5ULN,肝硬化、胆石症和肿瘤引起的胆汁淤积,ALP增高达5-20ULN。90以上肝外胆道阻塞患者血清ALP升高,升高程度和阻塞程度、病变程度成正比。,参考值范围: 40-110U/L,ALP iso-enzymes,临 床 意 义 Clinical significance ALP同工酶: 胆汁淤积性黄疸(cholestatic jaundice),尤其是癌性梗阻(carcinomatous obstruction)时,
45、100%出现ALP1,且ALP1 ALP2。 急性肝炎:ALP2,且ALP1ALP2。 肝硬化:ALP5,但不出现ALP1。,六、酸性磷酸酶及其同工酶,酸性磷酸酶 (acid phosphatase,ACP),1. 催化反应,作用类似ALP的磷酸酶(最适pH在7.0以下),2. 组织分布,ACP存在于人体不同组织,如前列腺、红细胞、血小板、肾脏、肝脏、脾脏、胃、肌肉及骨髓中,以前列腺含量最多。正常男性血清中ACP约有1/3-1/2来自前列腺。,3. 标本,血清或肝素抗凝血浆,37 或偏碱时灭活很快,pH降至6.5以下,酶比较稳定。,临床意义,主要用于诊断前列腺癌,血清ACP显著上升,转移性癌患
46、者可达40-50ULN。由于ACP不稳定,测定困难,目前正被其它前列腺标志物如PSA所取代。,七、淀粉酶及其同工酶,淀粉酶 (amylase,AMY/AMS),1. 催化反应,将多种糖化合物,如淀粉、肝糖原等水解成糊精、麦芽糖和少量葡萄糖等产物的一组酶。,2. 组织分布,人体胰腺含AMY最多,唾液腺也分泌大量AMY入口腔,还见于卵巢、肺、睾丸、横纹肌和脂肪组织中。 AMY是一种需钙金属酶,其最适pH在6.5-7.5之间,卤素和其它阴离子有激活作用。,3. 标本,多用血清或肝素抗凝血浆,其它抗凝剂都有抑制作用,不宜用去钙血浆测定AMY。,4. 临床意义,(1) 评价胰腺外分泌功能的一种辅助诊断指
47、标。 (2) 急性胰腺炎早期检测血AMY,在后期测定尿AMY更有价值。 (3) AMY诊断胰腺炎其增幅与病情不成比例时,常预示坏死性胰腺炎。,八、脂肪酶,脂肪酶 (lipase,LPS/LIP),胰腺外分泌酶,血清中LPS主要来自胰腺,少量来自胃肠粘膜。,LPS在急性胰腺炎时活性升高的时间早,上升的幅度大,持续的时间长,其诊断价值高于AMY。 临床发现,凡血清AMY升高的病例,其LPS均升高;而LPS升高者AMY不一定升高。,九、胆碱酯酶,胆碱酯酶 (choline esterase,ChE),一类催化酰基胆碱水解的酶类,人体内有两种。,ChE在肝脏合成后立即释放到血浆中,为评价肝细胞合成功能的灵敏指标。各种肝病,病情越差,血清ChE活性越低,持续降低无回升迹象者多预后不良。,各型肝胆疾病时常用酶学指标的变化概况,病例分析,某患,男,26岁。 主诉:乏力、厌油腻、恶心、肝区不适伴发热2周。 查体:皮肤、巩膜黄染;肝肋下2cm,质略硬(),有压痛,脾肋下1cm处可触及。 应做哪些实验室检查?,化验单,小 结 1.掌握血清酶的来源与去路及其变化的病理 机制 2.掌握临床常用血清酶、同工酶及其亚型 3.熟悉酶活性测定技术、酶的免疫化学测定 同工酶及其亚型测定 4.熟悉酶活性浓度定义及酶促反应进程。 5.了解酶的基本概念,底物浓度对酶促反应速度的 影响。,
链接地址:https://www.31doc.com/p-2723167.html