第7章真核生物的遗传分析.doc
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1、第七章 真核生物的遗传分析重点:真核生物的基因组; 真菌的遗传分析; 真核生物重组的分子机制。难点:顺序四分子分析。 第一节 真核生物基因组一、C值悖论二、N值悖论三、真核生物基因组DNA的复杂度一、C值悖论基因组(genome):一个物种单倍体的染 色体数目及其所携带的全部基因称为 该物种的基因组。genome - The complete set of sequences in the genetic material of an organism. It includes the sequence of each chromosome plus any DNA in organelles
2、.C值(C-value):是指生物体的单倍体基因组所含DNA总量。 每种生物各有其相对恒定的C值,不同物种的C值之间有很大差别。 最小的C值是支原体,小于106bp;最大的C值是某些显花植物和两栖动物,可达1011bp。 C值同生物的进化有什么关系? 生物的C值,即基因组的DNA总量是不是随着生物的进化而相应地增加? 一方面,随着生物结构和功能复杂程度的增加,需要的基因数量和产物种类越多,因此C值也相应地增加。 另一方面,在结构与功能相似的同一类生物中,以及亲缘关系很近的物种之间,则看不到这种规律。因此,物种的C值及其进化复杂性之间没有严格的对应关系,这种现象称为C值悖理(Cvalue par
3、adox)。C-value paradox: the lack of direct relationship between the C value and phylogenetic complex. 人们对C值悖理已经提出许多解释:包括基因组的部分或完全加倍、转座、返座已加工假基因、DNA 复制滑动、不等交换和DNA扩增等。Petrov等又提出一个解释是:各种生物基因组的大小是由于基因组中长期积累起来的过量的非编码DNA被清除的速率不同所造成的结果,即DNA丢失的速率愈慢,那么基因组DNA含量愈高。二、N值悖论 面对由基因组测序和注释所揭示出来的线虫、果蝇、植物以及人等的有关蛋白质编码基因的
4、数目如何进行解释? 比如: 人的基因组(3300Mb)25,000个左右的基因; 线虫基因组(97Mb)19,000个基因; 果蝇基因组(常染色质部分的120Mb)13,600个基因; 水稻基因组(389Mb)37,544个基因等等。 非常明显,果蝇基因组比线虫基因组大,进化地位比线虫高,而编码基因反而比线虫少;人的基因组应该是最复杂的,人的进化地位最高,但编码的基因还没有水稻基因组的多。 物种的基因数目与生物进化程度或生物复杂性的不对应性,这被称之为N值悖理(N value paradox)。 从N值悖理说明,生物体的复杂性不仅仅是基因数目的函数,随着生物体复杂性的增加,基因的大小和基因结构
5、的复杂性亦增加。 较为复杂的生物通过内含子的可变剪接使一个基因产生多个蛋白质分子。另外,随着生物体复杂程度的增加,其基因组中基因重复程度增加。基因结构复杂性的增加还体现在结构域的数目上。内含子的数目也是随着生物体复杂性的增加而增加的。三、真核生物基因组DNA的复杂度 真核生物基因组DNA C值和N值悖理现象都表明其DNA序列的复杂度,为此可通过复性动力学来检测基因组DNA序列的复杂性。也就是通过DNA的变性和复性反应的动力学过程分析DNA序列的性质,由于复性的速率取决于互补的DNA序列之间的随机碰撞,所以DNA复性是一个双分子二级反应。 l 序列复杂性l 同一类生物中基因组大小相差悬殊,其主要
6、差别在于“多余”DNA的量的差别。“多余”DNA量多,则基因组大;反之,则小。所谓“多余”DNA主要是重复序列。l 序列复杂性:是指不同序列的总长度,或l 者说:DNA分子中不重复碱基的总量(l 用bp来表示)。l 若一个DNA分子长度为106bp,完全不含重复顺序,则x=106(bp)。l DNA复性动力学l 基因组内单一序列和重复序列的组成情况,可通过DNA复性动力学研究来确定。l DNA复性:当变性DNA的两条互补链在除去l 变性因素后,可以重新或部分恢复成l 双螺旋结构。l ds DNA ssDNAl 复性的速率可用下列公式表示: l dC/dt=-kC2 其中,C是在t时单链DNA的
7、浓度,k是二级反应常数。上述公式可以重排为 -dC/C2=kdt 对上式积分整理得: C/C0 = 1/(1+kC0t) 这里C0是t0时DNA的初始浓度 该公式表明反应中单链DNA所占百分数(C/C0)是DNA浓度(C0)同反应时间(t)乘积的函数,通常用C0t来表示。 如C/C0对C0t作图可以得到下图的曲线,称为Cot曲线(见图54)。 当C/C0=0.5,即复性反应完成一半时(t1/2)的Cot值定义为 C0t1/2。18幻灯片19 C0t1/2除了决定于基因组的大小以外,还取决于每个基因的核苷酸序列的重复次数。重复次数越少则复性越慢, C0t1/2越大。 真核生物基因组的复性曲线往往
8、出现2个或3个明显不同的C0t1/2位置,说明这类基因组中包含着重复次数显然不同的几个成分。19幻灯片20 下图是假设的一个真核生物基因组复性曲线。l 真核生物基因组序列的类型:l 1)单拷贝序列l 在一个基因组中只有一个拷贝或23个拷贝。真核生物的大多数基因在单倍体中都是单拷贝的。l 2)中度重复序列l 中度重复序列中的重复单位平均长度约300bp,重复次数为10102。另一类中度重复序列的重复次数为103105。以回文形式存在的中度重复序列 3)高度重复序列 通常这些序列长度为6200bp,重复次数在106以上。这些重复序列大部分集中在染色体的异染色质区,特别是在着丝粒和端粒附近。 高度重
9、复序列中常有一些AT含量很高的简单串联重复序列。大多数高等真核生物都有20%以上的高度重复序列,而且数目变化很大,这类序列的多少对C值的影响可能最大。23幻灯片24 卫星DNA(satellite DNA)是一类高度重复的DNA序列。各种DNA在氯化铯梯度离心中,平衡时的浮力密度决定于它的GC含量,GC含量越高,浮力密度越大。对一个物种来说,当基因组DNA切断成数百个碱基对的片段进行超离心时,常在主要DNA带的前面或后面有一个次要的DNA带相伴随,这样的DNA即被称为卫星DNA。 隐蔽卫星DNA(cryptic satellite DNA):是用密度梯度离心时,存在于DNA主带中的高度重复序列
10、。 果蝇(D.virilis)基因组中有3种主要的卫星DNA,它们的核心序列非常相似,改变一个碱基,足以从型卫星序列变成或型卫星序列。或型卫星序列为D.virilis特有,型卫星序列存在于与上述果蝇相似的其他果蝇类中。果蝇(D.virilis)的卫星DNA第二节 真菌类的四分子分析与 作图一、顺序四分子的遗传分析二、非顺序四分子的遗传分析一、顺序四分子的遗传分析 粗糙链孢霉是子囊菌的真菌,属于低等真核生物,能进行无性繁殖和有性繁殖。 粗糙链孢霉减数分裂的特点: 1)每次减数分裂结果(四个孢子,或 其有丝分裂产生的八个子囊孢子)都保 存在一个子囊中;2)具有严格的顺序:四分子或八分子在子 囊中呈
11、直线排列直线排列四分子或 直线排列八分子。并且其子囊孢子在子 囊中的排列顺序与处在减数分裂中期 赤道板上染色单体的排列顺序完全一致 链孢霉减数分裂的4个产物留在一起,称作四分子,并且是顺序四分子。对四分子进行遗传学分析,称作四分子分析。 四分子分析是一种作图技术,仅用来对某些单倍体真核生物包含在一个结构内的一个减数分裂的产物,减数分裂四分子进行基因作图。有序排列的子囊孢子 顺序四分子在遗传分析上具有很多优越性 : 1)子囊孢子是单倍体; 2)子囊孢子在子囊中直线排列; 3)着丝粒可看成是一个基因座位。l 着丝粒作图l 着丝粒作图:利用四分子分析法,测定基因与着丝粒间的距离。l 原理:在一对非姐
12、妹染色单体间没有发生着丝粒和基因交换的减数分裂和发生了交换的减数分裂,其产物(四分子)中的等位基因在排列方式上是不同的。前者称为第一次分裂分离,又称M模式;后者称为第二次分裂分离,或称为M模式。第一次分裂分离和第二次分裂分离实验材料:红色面包霉 野生型:能合成赖氨酸,记为lys+,能在基本培养基(不含赖氨酸)上正常生长,成熟子囊孢子呈黑色; 赖氨酸缺陷型:不能合成赖氨酸,记为lys-,在基本培养基上生长缓慢,子囊孢子成熟较迟,呈灰色。 用不同接合型的lys+和lys-杂交,在对子囊进行镜检时发现子中lys+和lys-有六种排列方式。第一次分裂分离: 第二次分裂分离: 着丝点距离:将着丝点当作一
13、个基因位 点看待,计算基因位点与着丝点间 的交换值,估计基因与着丝点间的 遗传距离,称为着丝点距离。l 两个连锁基因的作图l nic+与+ade杂交,这两对基因形成的36种不同子囊型可归纳为7种基本子囊型。 根据nic与ade之间交换的情况,基本子囊又可划分为以下几种类型: 亲二型(PD):只有两种基因型,而且跟亲代相同。 非亲二型(NPD):有两种基因型,都跟亲本不同,是重组型。 四型(T):有四种基因型,两种基因型跟亲代相同,两种基因型跟亲代不同。表3 nic +ade得到不同子囊型的后代(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) ade ade ade ade ade nic
14、 ade nic nic ade nic ade nic nic ade nic ade ade nic nic ade nic ade nic nic nic ade nic M1 M1 M1 M1 M1 M2 M2 M1 M2 M2 M2 M2 M2 M2 (PD) (NPD) (T) (T) (PD) (NPD) (T) 808 1 90 5 90 1 5链孢霉的连锁图的制作:1)先计算nic与着丝粒之间的重组值; RF(着丝粒-nic) =(4)(5)(6)(7) 1000 1/2 100% = (5+90+1+5) 10001/2 = 5.05 %2)再计算ade与着丝粒之间的重组值
15、; RF(着丝粒-ade) =(3) (5) (6) (7) 1000 1/2 100% = (90+90+1+5) 10001/2= 9.30 %3)算出上述两个重组率后,还有三种可 能性要考虑: 无连锁,位于两个不同的染色体上; 有连锁,位于同一染色体的着丝粒的两旁; 有连锁,位于同一染色体的着丝粒的同侧。 a) 首先判断nic、ade基因是独立分配还是连锁。PD=808+90=898,NPD=1+1=2。如果这两个基因是自由组合的,可以预期PD:NPD=1,而实验结果是PDNPD。说明这两个基因不是自由组合,而是相互连锁的。 在判断两个基因是否连锁时,四分子类型中的T型的数据说明不了问题
16、。PD:NPD=1或1,则不连锁;PD:NPD1,则连锁。 b)再判断这两个基因在着丝粒同侧还是异侧。可以看出,着丝粒nic间不起交换,而着丝粒ade间发生交换(M1M2)的子囊数是90;着丝粒ade间不起交换,而着丝粒nic间发生交换(M2M1)的子囊数是5。两者子囊数之比90:518:1远远超过两重组率之比9.30%:5.05%=1.84:1。这表明,着丝粒nic的交换与差丝粒ade间交换不是独立的。排除二者在着丝粒异侧的可能性。 着丝粒nic间发生交换,大部分时间在着丝粒ade间也发生交换,这说明nic与ade应位于着丝粒的同侧。4)再计算nic-ade之间的重组值; RF(nic-ad
17、e) =(NPD+1/2 T) 总子囊数 = (2) + (6) + 0.5 (3) (4) (7) 1000 = (1+1) + 0.5 ( 90+5+5 ) 1000 =5.2% 5)最后画出正确的遗传图。二、非顺序四分子的遗传分析 酿酒酵母、购巢曲霉和单细胞藻类中的衣藻的每一个子囊中8个子囊孢子的排列是杂乱无序的。这类真菌的遗传分析可采用非顺序四分子分析方法。酿酒酵母的生活周期 酿酒酵母有二种交配型:a和。 单倍体营养细胞直接经有丝分裂繁殖,新的细胞由亲本出芽而来。 单倍体a和细胞融合产生一个二倍体细胞,a/该二倍体细胞在正常营养条件下是稳定的,而且通过出芽繁殖。而在氮饥饿时,a/细胞产
18、生孢子,进行减数分裂。在酵母中减数分裂产生的四个子囊孢子在子囊中是随机排列的。衣藻的生活周期: 和酵母一样,衣藻具单倍体营养细胞当氮源受限时,衣藻细胞形态上发生变化而成为配子。 有两种交配型: mt+ , mt- 同型配子间不能融合,仅相反交配型的配子能够融合产生二倍体的合子。在经过成熟过程后,该合子进入减数分裂,四个减数分裂的产物作为非顺序四分子在一个子囊中。 非顺序四分子分析 以酿酒酵母为例,如果要研究A、B基因是否连锁,并计算图距,首先要知道ABab时,无论有无连锁,只产生下列3种可能的无序四分子。 AB aB ab AB aB aB ab Ab Ab 孢子 ab Ab AB PD NP
19、D T 在这3种子囊当中,可以发现只有NPD和T有重组型,故这两种四分子类型是决定重组率的关键。由于T只有1/2重组型,所以RF=1/2T+NPD。 若RF=0.5,则A、B基因不连锁; RF0.5,则两基因座连锁。那么在减数分裂过程中A、B间可以发生非交换(NCO)、单交换(SCO)或双交换(DCO)。 T型四分子既可来自单交换,也可来自双交换。NPD是四线双交换产物。 如果假设双交换在四条染色单体间随机发生,那么4种双交换的频率应相同。即DCO=4NPD。而T型中来自DCO减数分裂的部分是2NPD,所以单交换的大小可以用下式表示:SCO=T-2NPD。 当我们估算出这一区域上SCO、DCO
20、的值之后,可以由这些数值推导出m值(这一区域平均每次减数分裂的交换数): m= SCO+2DCO =(T2NPD)+24NPD = T+6NPD 根据第五章作图函数一节中已知,将m换算成图距时要乘以50。则: 图距50(T+6NPD)cM 当PD=0.56,NPD=0.03,T=0.41时, a、b间的图距=50(0.4160.03)=29.5cM,而RFa-b=23.5cMa-b图距29.5cM。这是由于RF无法校正双交换数的影响。 该公式也适用于顺序四分子分析。当顺序四分子依次逐个取出培养,在操作上比较困难时,同样可采用非顺序四分子分析方法。第三节 真核生物重组的分子机制一、同源重组发生在
21、减数分裂前期二、同源重组的分子机制三、联会复合体与重组一、同源重组发生在减数分裂前期 同源重组( homologous recombination)又称普遍性重组( generalized recombination),它的发生是依赖于较大范围的DNA同源序列的联会。真核生物的遗传重组发生在减数分裂时期的同源染色体的非姊妹染色单体之间,而且染色体或DNA分子之间相互交换对等的部分。 同源重组中负责DNA配对和重组的蛋白质无碱基序列的特异性,只要两条DNA序列接近,重组就可以在此序列中任何一点发生。 当然也存在重组热点,即某类序列发生重组的概率高于其它序列。此外,真核生物的染色质状态影响重组,如
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