Genomic组织和染色体的小鼠附睾视黄酸结合蛋白基因.doc

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1、Genomic组织和染色体的小鼠附睾视黄酸结合蛋白基因（ME-RABP）定位。Abstract文摘The murine epididymal retinoic acid-binding protein (mE-RABP) is specifically synthesized in the mouse mid/distal caput epididymidis and secreted in the lumen.鼠类附睾的视黄酸结合蛋白(mE-RABP)是专门合成在老鼠中/远端头epididymidis和中分泌腔。In this report, we have demonstrated by

2、Southern blot analysis of genomic DNA that mE-RABP is encoded by a single-copy gene.在这篇报告中,我们已经演示了由南方污点,mE-RABP基因组DNA的分析是由基因进行编码的单份。A mouse 129/SvJ genomic bacterial artificial chromosome (BAC) library was screened using a cDNA encoding the minor form of mE-RABP.一只老鼠129 / SvJ基因组的细菌人工染色体(BAC)库是使用一个cD

3、NA筛选编码小mE-RABP形式。One positive BAC clone was characterized and sequenced to determine the nucleotide sequence of the entire mE-RABP gene.一个积极的BAC克隆特点和测序来确定整个mE-RABP核苷酸序列的基因。The molecular cloning of the mE-RABP gene completes the characterization of the 20.5-kDa-predicted preprotein leading to the min

4、or and major forms of mE-RABP.分子克隆的mE-RABP基因完成描述20.5负责预测preprotein导致轻微和主要形式的mE-RABP。Comparison of the DNA sequence of the promoter and coding regions with that of the rat epididymal secretory protein I (ESP I) gene showed that the mE-RABP gene is the orthologue of the ESP I gene that encodes a rat e

5、pididymal retinoic acid-binding protein.比较DNA序列的发起人和编码区域与鼠附睾的分泌蛋白我(ESP我)基因表明,mE-RABP基因是orthologue的ESP我的编码基因鼠附睾的视黄酸结合蛋白。Several regulatory elements, including a putative androgen receptor binding site, CACCC-boxes, NF-1, Oct-1, and SP-1 recognition sites, are conserved in the proximal promoter.一些监管元素

6、,包括一个假定的雄激素受体结合位点,“CACCC-boxes,“nf 1,10月1日,sp 1识别网站,是守恒的近端启动子。Analysis of the nucleotide sequence of the mE-RABP gene revealed the presence of seven exons and showed that the genomic organization is highly related to other genes encoding lipocalins.分析mE-RABP核苷酸序列的基因显示存在七个外显子和显示,基因组织是高度相关的其他基因编码lipoc

7、alins。The mE-RABP gene was mapped by fluorescent in situ hybridization to the A3-B region of the murine chromosome 2.mE-RABP的基因所绘制荧光原位杂交(a3 b区域的小鼠染色体2。Our data, combined with that of others, suggest that the proximal segment of the mouse chromosome 2 may be a rich region for genes encoding lipocalin

8、s with a genomic organization highly related to the mE-RABP gene.我们的数据,加上其他人的,表明近段鼠标染色体2可能是一个富裕的地区lipocalins基因编码与基因组组织高度相关的mE-RABP基因。Structure and putative function of a murine epididymal retinoic acid-binding protein (mE-RABP).结构和假定的函数的鼠附睾的视黄酸结合蛋白(mE-RABP)。Abstract文摘The murine epididymal retinoic a

9、cid-binding protein (mE-RABP) is specifically synthesized in the mouse mid/distal caput epididymidis and secreted in the lumen.鼠类附睾的视黄酸结合蛋白(mE-RABP)是专门合成在老鼠中/远端头epididymidis和中分泌腔。In this report, we have demonstrated by Southern blot analysis of genomic DNA that mE-RABP is encoded by a single-copy ge

10、ne.在这篇报告中,我们已经演示了由南方污点,mE-RABP基因组DNA的分析是由基因进行编码的单份。A mouse 129/SvJ genomic bacterial artificial chromosome (BAC) library was screened using a cDNA encoding the minor form of mE-RABP.一只老鼠129 / SvJ基因组的细菌人工染色体(BAC)库是使用一个cDNA筛选编码小mE-RABP形式。One positive BAC clone was characterized and sequenced to determ

11、ine the nucleotide sequence of the entire mE-RABP gene.一个积极的BAC克隆特点和测序来确定整个mE-RABP核苷酸序列的基因。The molecular cloning of the mE-RABP gene completes the characterization of the 20.5-kDa-predicted preprotein leading to the minor and major forms of mE-RABP.分子克隆的mE-RABP基因完成描述20.5负责预测preprotein导致轻微和主要形式的mE-RA

12、BP。Comparison of the DNA sequence of the promoter and coding regions with that of the rat epididymal secretory protein I (ESP I) gene showed that the mE-RABP gene is the orthologue of the ESP I gene that encodes a rat epididymal retinoic acid-binding protein.比较DNA序列的发起人和编码区域与鼠附睾的分泌蛋白我(ESP我)基因表明,mE-R

13、ABP基因是orthologue的ESP我的编码基因鼠附睾的视黄酸结合蛋白。Several regulatory elements, including a putative androgen receptor binding site, CACCC-boxes, NF-1, Oct-1, and SP-1 recognition sites, are conserved in the proximal promoter.一些监管元素,包括一个假定的雄激素受体结合位点,“CACCC-boxes,“nf 1,10月1日,sp 1识别网站,是守恒的近端启动子。Analysis of the nuc

14、leotide sequence of the mE-RABP gene revealed the presence of seven exons and showed that the genomic organization is highly related to other genes encoding lipocalins.分析mE-RABP核苷酸序列的基因显示存在七个外显子和显示,基因组织是高度相关的其他基因编码lipocalins。The mE-RABP gene was mapped by fluorescent in situ hybridization to the A3-

15、B region of the murine chromosome 2.mE-RABP的基因所绘制荧光原位杂交(a3 b区域的小鼠染色体2。Our data, combined with that of others, suggest that the proximal segment of the mouse chromosome 2 may be a rich region for genes encoding lipocalins with a genomic organization highly related to the mE-RABP gene.我们的数据,加上其他人的,表明近

16、段鼠标染色体2可能是一个富裕的地区lipocalins基因编码与基因组组织高度相关的mE-RABP基因。基因复制产生新的17千道尔顿载脂蛋白的特定区域，显示附睾中的表达及睾丸因子（S）规例“1 2 ， 让-雅克Lareyre2 3 弗吉尼亚P.温弗瑞， 4 苏珊卡斯帕， 5 大卫E.王， 6 罗伯特J. Matusik，7 加里E.奥尔森和 8 玛丽 - 克莱尔Orgebin的-克里斯特-作者背景妇产科部门（J.-JL，M-CO-C），生物化学（DEO），细胞生物学（VPW，SK，RJM，GEO，M-CO-C），泌尿外科（SK RJM）和生殖生物学研究中心（SK，DEO，RJM，GEO，M-C

17、O-C），范德比尔特大学，纳什维尔，田纳西州372329 解决所有的通信和重印的要求：博士玛丽-克莱尔Orgebin的克里斯特，生殖生物学研究中心，范德比尔特大学医学院，医学中心北厅C-3306，纳什维尔，田纳西州37232-2633。电子邮件： mc.orgebin克里斯特 mcmail.vanderbilt.edu。 下一节抽象利用转基因小鼠，我们最近的研究表明5 kb的小鼠附睾视黄酸结合蛋白（ME-RABP）基因的5-侧翼区包含了所有需要的空间和时间在附睾基因表达的信息。要识别的重要的顺式 -参与组织，区域，和细胞特异性表达mE与RABP基因的DNA调控元件（），5-kb的DNA片段进行

18、了测序。的核苷酸序列的计算机分析表明位于一个新的基因的1.7 kb的从mE与RABP基因的转录起始位点的上游存在。分析表明，新的基因的开放阅读框，编码一个假定的17-kDa的载脂蛋白（命名为mEP17）到我的RABP有关。A 600 bp的互补DNA编码mEP17的克隆附睾的总RNA的3-cDNA末端快速扩增。通过Northern印迹在附睾两个mEP17 RNA的物种（1和3.1 kb大小）进行检测，但并不在其他组织中测试。原位杂交分析表明，与ME-RABP不同信使RNA（mRNA），这是表示在远端附睾头部，mEP17 mRNA的检测只在主细胞的起始段。空间的表达和同源性与我的RABP的建议，

19、mEP17可以作为类维生素A载体蛋白在附睾。mEP17 mRNA的表达消失5天postcastration。四天后，单方面阉割，mEP17表达几乎消失在附睾中的阉割，但不完整的。此外，双边去势小鼠的睾丸激素替代未能恢复基因的表达。我们的结论是mEP17基因的表达是依赖于管腔液 循环中睾丸因素。加上我们的研究结果表明，ME-RABP和mEP17的基因所产生的重复，进化导致了不同区域的特定基因的表达和调控的附睾。哺乳动物精子经过一个复杂的过程，在附睾中成熟，在他们前进的活力和受精能力（1）。在附睾精子暴露于一个微环境创建的上皮细胞的吸收和分泌活动。据认为，附睾分泌蛋白之间的相互作用的精子质膜参与精

20、子成熟过程。主要是附睾功能受雄激素（2）。然而，维生素A的饮食或显性负的维甲酸受体在小鼠附睾尾（3）的结果在变性的上皮细胞和男性不育症的表达。因此，附睾功能也依赖于提供的视黄醇。我们以前发现的小鼠附睾分泌蛋白（MEP）（4），现在被命名为小鼠附睾视黄酸结合蛋白（ME-RABP），这是专门的鼠标中/远端附睾头部主细胞合成并分泌到的小管（4）。一旦管腔流体中，ME-RABP是与精子接触，但不裹紧它们，因为它洗涤（4）后，未检测到。推导的氨基酸序列的ME-RABP是两个大鼠附睾视黄酸结合蛋白依次命名的蛋白B / C（5，6）具有高度同源性（75的同一性，90的同源性），附睾结合蛋白I和- 2（7），

21、附睾分泌蛋白I（ESPI）（8），和E-RABP的（9）。这些蛋白质并不仅限于啮齿动物附睾，ME-RABP和ESP-I（10），因为两个公猪附睾分泌蛋白的N-末端的序列是高度相似。mE与RABP和ESP-I蛋白属于脂质运载蛋白超家族（11，12）。迄今报道表明，脂笼蛋白具有一个8向上和向下滞留在一端封闭的桶反过来由一个单一的-螺旋形成的疏水性的结合腔的三维结构分析。疏水口袋适用于小的亲脂性配体的非共价结合和运输。我RABP结合活性维甲酸（9 - 顺式和全反式维甲酸）（13），因此可以作为一个载体蛋白介导的视黄酸信号通路在小鼠附睾（14）。编码基因的分离和ME-RABP映射到的轨迹A3，B的小鼠

22、染色体2（15）。最近，我们已经表明，5 kb的，但不是0.6 kb的，针对性的高水平的氯霉素乙酰转移酶报告基因的表达，在转基因小鼠中的主要细胞的中期/远端附睾头部的的ME-RABP基因的5-侧翼区（16）。转基因表达的时间和空间内源性我RABP信使RNA（mRNA）的表达模式是一致的，并受雄激素。这表明，顺 -DNA调控元件在5 kb的上游从我的RABP基因位于附睾，区域和cellspecific基因的表达和调控的的重要。在这项研究中，我们确定了在5 kb的mE与RABP基因的一个新的基因编码的17-kDa的载脂蛋白的5-侧翼区。这种蛋白质被命名为mEP17小鼠附睾蛋白分子量为17 kDa。

23、Northern杂交和原位杂交分析，组织，区域和细胞特异性表达以及调控的mEP17表达进行了研究。此外，我们证明了一个mEP17-like基因在大鼠和仓鼠基因组保守。保护mEP17-like基因的表达表明，它可能在进化过程中发挥重要的作用，男性的生育能力。上一节下一节材料和方法动物所有的实验都按照美国国立卫生研究院在实验室动物护理和使用指南。小鼠保持温度恒定的条件下（201）和轻（12小时/天），与水和食品可随意。机关成人B6D2 / F 1小鼠（哈伦大鼠公司，印第安纳波利斯，IN），。光甲氧（Mallinckrodt公司，公司的Mundelein，IL）麻醉下进行阉割或传出导管结扎术的腹部路

24、线。必要时，进行激素替代疗法，每日皮下注射丙酸睾丸酮（2克/克），溶于香油。处死小鼠，在最后一次注射后第1天，并切下器官，立即在液氮中冷冻，并在-80下存储基因组DNA片段的分离和测序从Bac的10983，含5 kb的mE与RABP基因（15）的5-侧翼区的，克隆的DNA片段被亚克隆在pBluescript SK +使用合适的酶（Promega公司，麦迪逊，WI）。DNA模板进行测序纯化的质粒试剂盒（QIAGEN，加利福尼亚州Santa Clarita）。进行测序反应中所描述的热测序荧光标记的引物循环测序试剂盒（Perkin-Elmer公司，Foster市，加利福尼亚州）。分离的DNA片段中的

25、变性PAGE（6丙烯酰胺凝胶），并使用ABI 373A自动测序仪（PE应用生物系统，Foster市，加利福尼亚州）进行分析。使用GeneJockey序列处理器（BIOSOFT，米尔敦，NJ）中的核苷酸序列进行了分析。引物延伸分析提取总RNA，使用先前描述的方法（17）从小鼠附睾。mEP17PE2引物（5-CTTCTCTGGTACAAGCTCCACCCTGGT-3）针对mEP17 mRNA的放射性标记的在100次的存在下，使用T4多核苷酸激酶- 32 P ATP（3000居里/毫摩尔，Amersham Pharmacia Biotech公司，州Arlington Heights，IL）根据制造商

26、的说明（New England Biolabs公司，公司）。对于每个反应，10微克附睾的总RNA或转移RNA进行杂交1皮摩尔（10 5 的dpm）mEP17PE2引物为12小时在35在10微升的溶液含有0.04 米 PIPES（pH为6.4），1 米 EDTA，和80（体积/体积）甲酰胺。进行RT的在20l含有50 米的Tris-HCl（pH 8.3）中，30 米氯化钾，每个脱氧-NTP 米 0.5米8米的MgCl 2，6 米二硫苏糖醇，和50 U禽成髓细胞瘤病毒（AMV）逆转录酶（Promega公司）。将样品在42孵育30分钟，然后再加入50单位AMV逆转录酶，并保温1小时以上。细长的放射性

27、标记的片段，加载上变性PAGE（7丙烯酰胺凝胶）旁边使用测序酶测序试剂盒（Amersham Pharmacia Biotech公司）进行测序反应。的克隆p 欣 DIII（15）和mEP17PE2引物被用来作为模板和引物，分别。分离的互补DNA（cDNA），编码mEP17对于RT，2微克附睾总RNA孵育在50米米的 Tris-HCl（pH值8.3）;75米米氯化钾;10米米二硫苏糖醇;3米米 的MgCl 2 ;0.5米米每个脱氧（四）-GTP，的dATP，dCTP和dTTP，2 U /l的RNasin（Promega公司）;10克/毫升的寡核苷酸RACEIII（5-CAGCTGCAGGTACCG

28、GATCCTCGAGAAGC（T）18 -3）和200 U的莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶的1小时在42下变性5分钟的DNA / RNA杂交体在90，并存储在-80下使用100毫微克的混合物中含有0.2米米每个三磷酸，的dATP，dTTP的，和dCTP 孵育的cDNA进行PCR ; 各引物的1米（FwmEP17cDNA，5-GGCCCTGAGATGGAAGCTAGG-3; RiIII，5-GCAGGTACCGGATCCTCGAGAAG-3），1反应缓冲液II（Perkin-Elmer公司）;及1单位的AmpliTaq（Perkin-Elmer公司公司）。DNA扩增1分钟组成的29个循环，于94，

29、在55，2分钟和2分钟，72的PCR产物进行纯化，在2（重量/体积）的琼脂糖凝胶上，连接到pGEM-T很容易质粒（Promega公司），和测序。的基因组DNA的Southern印迹分析从成年雄性小鼠（株129 SVJ）的肝脏中，成年雄性大鼠（Sprague Dawley系），和成年雄性金黄仓鼠如前所述（18）提取基因组DNA 。消化的DNA（15微克）用40 U 欣 DIII（Promega公司），在0.8（重量/体积）的琼脂糖凝胶上电泳，然后在0.25 HCl 孵育10分钟，在0.5 NaOH和1.5米的 NaCl为30分钟，并在0.5 米的Tris-HCl（pH为7.5），1米米乙二胺四乙

30、酸，和1.5 米的NaCl的两倍，每次15分钟。的DNA片段转移到Hybond N +尼龙膜（Amersham Pharmacia Biotech公司）过夜，印迹法（19）。将膜在80下烘烤2小时，并在42预杂交3小时，在6SSC（标准柠檬酸盐），1（重量/体积）SDS，100微克/毫升鲑鱼精子DNA，50（体积/体积）甲酰胺，和5（重量/体积）硫酸葡聚糖。随机引物的32 P的放射性标记探针的合成使用的Rediprime DNA标记系统（Amersham Pharmacia Biotech公司），温育过夜（10 6的dpm /毫升）。洗涤过 滤器一次，2SSC中30分钟后，一次15分钟，一次在

31、2SSC和0.1（重量/体积）SDS，15分钟，一次在2SSC和0.1（重量/体积）SDS在0.2SSC和0.1（重量/体积）SDS，在65下15分钟，一次在0.1SSC和0.1（重量/体积）SDS在65，持续15分钟之前被放射自显影为0.5-4天-80 C与超薄膜的，MP薄膜（Pharmacia公司）。Northern杂交总RNA（10微克），在65下变性15分钟，并在冰上冷却。RNA样品被装上的1（重量/体积）含有20米米 MOPS（pH值为7）米，5米 的醋酸钠米 EDTA ，1米，和6（体积/体积）的甲醛的琼脂糖凝胶电泳，然后转移到一个到Hybond N +尼龙膜（Amersham P

32、harmacia Biotech公司）通过杂交过夜，在20SSC。膜洗涤一次，在2SSC洗涤，干燥，并烘烤2小时，在80预杂交3小时，在42进行，在50（体积/体积）甲酰胺，6SSC，5Denhardt氏溶液， 100微克/毫升鲑鱼精子DNA，0.1（重量/体积）SDS，然后随机引物 32 P-标记的ME-RABP制备的cDNA与随机总理DNA标记试剂盒（Amersham Pharmacia Biotech公司）中加入并保温过夜。洗涤过 滤器一次，2SSC中30分钟后，一次15分钟，一次在2SSC和0.1（重量/体积）SDS，15分钟，一次在2SSC和0.1（重量/体积）SDS在0.2SSC和

33、0.1（重量/体积）SDS 15分钟，而且一旦在0.1SSC和0.1（重量/体积）SDS在65，持续15分钟之前被放射自显影与超薄膜的MP（Amersham Pharmacia Biotech公司）。北的印迹reprobed与克隆的18S基因规范加载RNA的样品。使用图像光密度计测定的相对吸光度的mEP17和18S RNA（型号GS-670，Bio-Rad实验室，公司，里士满，加利福尼亚州）和应用分子分析员。原位杂交上进行非同位素原位杂交（20，21）4 - 6-m厚的冷冻切片，新鲜冰冻鼠标附睾。切片固定在4多聚甲醛在0.1 米的磷酸钠缓冲液，pH值7.2，然后温育10分钟，在PBS中含有5微

34、克/毫升蛋白酶K两个在PBS中漂洗后，切片在0.25乙酸酐在孵育0.1 米三乙醇胺，pH为8.0，为15分钟。义和反义核糖探针制备的20-l的转录反应含有SP6（Promega公司）或T7（New England Biolabs公司，公司，富康，MA）的聚合酶; 1转录缓冲液;1米米每个ATP，CTP，和GTP;0.65米米 UTP;0.35米米地高辛UTP（罗氏，印第安纳波利斯，IN）和1g线性化F3 mEP17基因的质粒携带。非法团核苷酸上除去一个色度分拆-100500米米氯化钠，20米米的Tris-HCl（pH值7.5），和1 m 米的EDTA（STE）柱（CLONTECH Labora

35、tories公司，加利福尼亚州），帕洛阿尔托。地高辛的核糖探针被变性在805分钟，在杂交缓冲液组成的50（体积/体积）甲酰胺，10（重量/体积）的葡聚糖硫酸，4SSC，1Denhardt氏试剂，和0.5毫克/毫升稀释酵母转移RNA的部分将载玻片在55下过夜温育在室温下洗涤5分钟，在2SSC漂洗STE，然后保温30分钟在STE含有40克/毫升核糖核酸酶A的切片依次为各5分钟，2SSC，50甲酰胺在50，然后在室温下以1SSC，和最后用0.5SSC洗涤。为了检测杂交的探针载玻片百米米的Tris-HCl（pH为7.5）和150米的米的NaCl 中漂洗，封闭1 h百米米的Tris-HCl（pH为7.5

36、）和150米的米的NaCl含有2马血清和0.1的Triton X-100（封闭溶液），并温育1小时，在1:500稀释碱性磷酸酶共轭antidigoxigenin的封闭溶液（Roche公司）。载玻片在封闭溶液，然后百米米的Tris-HCl（pH 9.5）中，百米米的NaCl，和50 m 米 的MgCl 2中的底物缓冲液中漂洗三次。显色底物缓冲液中进行，含有0.17米米 5 -溴-4 -氯-3 -吲哚基磷酸酯，10米米 N -乙基马来酰亚胺，和1 m 米左旋咪唑的内源性碱性磷酸酶作为抑制剂。彩色显影带10米的米的Tris-HCl（pH 8.0）中和1 m 米 EDTA 停止。第一个，卡尔蔡司Axi

37、ophot（纽约，NY）采用明视场和相衬光学进行了检查，并拍摄。上一节下一节结果的mEP17基因的鉴定最近，我们已经表明，5 kb的5-侧翼区mE与RABP基因的高水平的表达的外源基因的转基因小鼠（16）中的主细胞的中间/远端附睾头部为目标。要确定需要的的ME-RABP基因的组织和区域特异性表达的顺式 DNA调控元件，这5 kb的启动子片段被完全测序。一种基于计算机的碱基序列的分析揭示的开放阅读框（ORF），编码34个氨基酸残基的存在。这ORF分析发现弱的同源性，与ME-RABP蛋白在第4外显子编码的域。此外显子之间的大小非常保守基因编码脂笼蛋白，编码序TDY，脂笼蛋白之间是高度保守的，被认为

38、是在这些蛋白质的三维结构体涉及。我们推测此ORF的基因编码一个新的载脂蛋白和脂质运载蛋白超家族的其他成员，这种基因的基因组结构将得到保护。因此，我们预测国产化的几个外显子，其中外显子1（图1 ）。预测的外显子的DNA序列，使我们能够设计一个DNA的底漆（FwmEP17cDNA），它被用于克隆相应的cDNA的3-cDNA末端快速扩增（3-RACE图; 1 ）。由于5 kb的基因组DNA序列，基因表达局限于附睾，附睾的总RNA反转录使用RACE III底漆。一个完整的全长cDNA（694 bp）的生成的PCR使用FwmEP17cDNA和RiIII引物（图2 ）的。的外显子/内含子边界序列的cDNA

39、和基因组DNA之间的比较证实了。基因组组织，由7个外显子打断了6个内含子，是那的的ME-RABP基因相同。此外，我们的结果表明，也被严格保守的基因之间的外显子/内含子边界。我们也注意到，mEP17和我RABP基因（图2 ）的短18-BP的富含嘧啶核苷酸序列内的3非翻译区保守的。 查看大图：在此页 在一个新的窗口 下载为PowerPoint幻灯片F IG。1。基因组组织的mEP17基因。mEP17基因位于上游的ME-RABP基因内的轨迹A3，B小鼠染色体2。外显子的大小表示的核苷酸。和主要的转录起始位点（1 nt）的mE与RABP基因的每个外显子之间的距离表示在千碱基。这两个基因的主要转录起始位

40、点的虚线箭头表示 。引物，用于扩增全长cDNA的3-RACE的mEP17 FwmEP17cDNA和RiIII，进行说明。GXW和TDY，和脂质运载蛋白蛋白质的三维结构体的被认为是很重要的两个半胱氨酸残基（C）的两个重要的图案，也表示。 查看大图：在此页 在一个新的窗口 下载为PowerPoint幻灯片F IG。2。的全长cDNA编码mEP17的（克隆F3）的核酸序列。假定的信号序列是 盒装和阴影的。盒装的保守结构域，GXW和TDY和两个半胱氨酸残基保守的脂质运载蛋白超家族的成员。推测的多聚腺苷酸信号5-AATAAA - 3“的底线。mEP17和我RABP基因18 bp的保守的富含嘧啶的区域用虚

41、线表示。分析的ORFORF推导出的694 bp的cDNA编码175个氨基酸的估计的19.8 kDa的多肽等电点5.69（图2 ）。水疗法模式的前体的分析表明，在第21个氨基酸残基构成的跨膜结构域（图3 ）的。此2.4-kDa的域中可能是一个信号肽，因为它是1）高度疏水性的，2）类似的协议与滑动窗口/矩阵评分的方法，和-1 mE与RABP蛋白的，和3）的信号肽， -3规则预测信号肽切割（22）。这一观察结果意味着，新的基因编码的一个假定的17-kDa的成熟蛋白（17.39582-17.61202 kDa的pI值5.69-5.94），可被分泌到管腔液 。因此，我们命名为新的基因，mEP17，小鼠附

42、睾蛋白分子量为17 kDa。 查看大图：在此页 在一个新的窗口 下载为PowerPoint幻灯片F IG。3。水疗法分析（Kyte和Doolittle）为mEP17。的21个第1个氨基酸残基的mEP17编码2.4 kDa的（黑色区域）的疏水性高的域。严格的截止限制（DAS;跨膜预测服务器）的信号肽是由虚线表示。氨基酸的位置表示在图的底部。该mEP17氨基酸序列与GenBank数据库（图4 ）相比。这是有据可查，脂质运载蛋白超家族的份额的成员数的高度保守的氨基酸序列基元认为是重要的蛋白质的三级结构，但具有较低的总体序列同一性（20）和相似性（50）（23，24）。正如预期的那样低，但意义重大，身

43、份被发现的脂质运载蛋白超家族的成员，包括马lactoglobulin（24.9）（25），鸡quiescencespecific蛋白（24.3）（26），我RABP（23.9）（12），人胎盘蛋白14 kDa的（23.4），（27），ESP（22.9），（5），鼠尿蛋白IV（21）（28），和蜥蜴附睾分泌蛋白IV（15.5）（29）。mEP17蛋白具有三个结构保守区域（TDY，GXW和两个半胱氨酸残基），已经提出了被认为是一种脂质运载蛋白（30）的蛋白质的DNA是一个先决条件。这些图案被编码外显子4，2，3，和6，分别作为以前报道的其他基因编码脂笼蛋白。 查看大图：在此页 在一个新的窗口 下载

44、为PowerPoint幻灯片F IG。4。的氨基酸序列的mEP17与GenBank数据库中，并进行了比较，发现类似的脂质运载蛋白超家族的成员hoLAC，马的-乳球蛋白（25）; QSP，静止特定蛋白（26）; ME-RABP，鼠附睾-视黄酸结合蛋白（12）;大鼠ERABP，大鼠附睾视黄酸结合蛋白（5）; PP14，人胎盘蛋白14 kDa的（27）; MUP4，小鼠尿蛋白4（28）; LESPIV，蜥蜴附睾分泌蛋白IV（29）。的启动子区域的分析的mEP17基因的转录起始位点被确定使用附睾的总RNA作为模板和的mEP17PE2位于第一外显子的引物（图5 ）的引物延伸。两个主要的转录起始位点分别定

45、位了22和18个核苷酸的假定，翻译起始位点，编号分别为1和5，。两个未成年的转录起始位点在2位和4位也被检测。甲推测的TATA盒（TATAAG 5-3）和一个CAAT盒（5-CCAAT-3）的位置处，分别是-26和-73（图6 ）本。一个假定的SP 1的转录因子结合位点位于位置-240。一个假定的视黄酸反应元件（RARE）所构成的直接重复分离BP（DR1）是目前位置-259。 查看大图：在此页 在一个新的窗口 下载为PowerPoint幻灯片F IG。5。mEP17 mRNA的5-端的引物延伸分析。从附睾或转移RNA提取的总RNA与32 P-放射标记的mEP17PE2引物反转录，并延长使用AM

46、V RT如材料和方法中所述。泳道CTA和G是35 S-放射性标记的DNA，满分，使用mEP17PE2引物和p 欣 DIII克隆为模板进行测序反应。本地化转录起始位点的两个主要的（箭头）和两个未成年人（箭头）表示。 查看大图：在此页 在一个新的窗口 下载为PowerPoint幻灯片F IG。6。，分别公认的顺式 DNA调控元件内的mEP17基因的5-侧翼区的定位。 虚线箭头和箭头指示的主要和次要的转录起始位点。计算机分析出使用1.3版本TFSEARCH（裕秋山：TFSEARCH：寻找转录因子结合位点，http:/www.rwcp.or.jp/papia/）。ARBS，雄激素受体 结合位点;罕见，

47、视黄酸反应区域SP1，刺激蛋白1; SRY基因，性别决定区Y基因产品，C / EBP，CCAAT /增强子结合蛋白AP-1，激活蛋白1; AP-4，激活蛋白4 SOX-5，SRY-HMG box基因5。甲2.5-kb的生态 RI限制性片段重叠的p 欣 DIII克隆的分离出的基因组的BAC克隆10983（15）来表征（图6 ）的mEP17基因的5-侧翼区的1.9 kb的。一种计算机基的DNA序列分析揭示了存在的一个假定的雄激素受体 结合位点的位置-342。还注意到一些假定激活蛋白-1和c-ETS 顺 -DNA的调节元件，以及几个潜在的性别决定区Y基因产品相关的转录因子结合位点的存在下。另一个相关

48、基因的mEP17基因或假基因的小鼠基因组中可能存在的694-bp的32 P-放射标记的mEP17 cDNA用于探测鼠标应变129基因组DNA的Southern印迹实验中（图7 ）。与大部分所用的限制性内切酶，得到一种复杂的杂交模式。特别是，两个频带（3.8和9 kb大小）时检测到的欣 DIII使用限制性内切酶。9-kb的 欣 DIII限制性片段，但不的3.8-kb DNA片段，是在协议与mEP17的基因位点的限制性图谱。的3.8-kb的欣 DIII限制性片段无法由不同等位基因的mEP17基因的存在下进行说明，因为该DNA片段时，未检测到的的ME-RABP的cDNA或mE与RABP启动子的作为探针（15） 。此外，质粒Bac的10983，含有175 kb的mEP17的基因位点，与