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1、吉 林 农 业 科 技 学 院学 士 学 位 论 文论 文 题 目: 不同配方稀释液对银黑狐精液冷冻 保存质量的影响 年 级 专 业: 08级野生动物与自然区保护管理 学 生 姓 名: 学 号: 0802605 指 导 教 师: 评 阅 教 师: 完 成 日 期: 2012年5月10日 吉林农业科技学院不同配方稀释液对银黑狐精液冷冻保存质量的影响不同配方稀释液对银黑狐精液冷冻保存质量的影响学 生: 专 业: 野生动物与自然保护区管理指导教师: 摘 要用4种稀释液对5只12岁的健康种银黑狐精液进行体外低温保存,采用伊红-苯胺黑法检测精子活率,低渗肿胀法检测精子质膜的完整性,考马斯亮蓝染色法检测精
2、子的顶体状态。结果表明:氨基乙酸稀释液低温保存时精子的活率、质膜的完整性、顶体的完整性明显优于其他3种稀释液,在第3d时,精子活率为(63.592.48) %,质膜完整性为(63.572.30)%,顶体完整性为(65.272.49)%。关键词:银黑狐;精液;冷冻保存;稀释剂- I -不同配方稀释液对银黑狐精液冷冻保存质量的影响The different formulations to dilute silver and black fox semen cryopreservation quality influenceName:Major: Wild animals and nature re
3、serve managementTutor: SAbstract With four dilutes to five dilute only 1 2 years old of the health of the silver and black fox semen in low temperature preservation, the Iraqi red-aniline black method to detect sperm live rate, low permeability swelling method to detect the integrity of the sperm of
4、 membrane, take an examination of MaSiLiang blue staining method to detect the sperm of the top body condition. The results show that: the amino acid low temperature preservation dilute sperm live rate, the integrity of the plasma membrane, top the integrity of the body is much better than other thr
5、ee diluent, at 3 days , sperm live rate is (63.592.48) %, plasma membrane integrity for (63.57 2.30) %, top body integrity for (65.272.49) %. Key Words:Silver black fox;semen;cryopreservation;thinner- III -目 录摘 要IAbstractII前 言11 材料与方法21.1 材料21.1.1 试验动物21.1.2 试验地点21.2 精液的采集21.3 精液的稀释保存21.3.1 稀释液配方21.
6、3.2 精液的稀释31.3.3 精液的保存31.4 精液品质评价31.4.1 精子活率的检测子活率的检测31.4.2 质膜完整性的检测41.4.3 顶体状态的检测42 结果与分析42.1 伊红苯胺黑染色法检测精子活率42.2 低渗肿胀试验检测精子质膜完整性52.3 考马斯亮蓝染色法检测银黑狐精液中顶体完整精子的比率62.4 银黑狐精液在不同稀释剂保存下不同方法间的相关系数63 讨论73.1 卵黄对精液质量的影响73.2 甘油对精液质量的影响7结 论8参 考 文 献9致 谢10不同配方稀释液对银黑狐精液冷冻保存质量的影响前 言目前,狐人工授精技术作为养狐业的一项重大技术,在引进芬兰蓝狐改良我国现
7、有蓝狐品质的过程中,已愈来愈被广大养狐者所重视。随着人工授精技术的不断开展,精液的体外保存就显得十分重要。目前生产中主要使用鲜精进行人工授精,受孕率也比较理想,但精子的存活时间短,使优良的种狐资源难以得到充分利用,造成一些优良精液的浪费。由于精子解冻后的低成活率和人工授精后的低繁殖率,使得银黑狐精液冷冻技术难以得到推广1。精液的低温保存可以减少冷冻对精子的损伤,而且存活时间比常温时明显延长,可用于人工授精。但随着体外保存时间的延长,精子的受精能力会逐渐降低。所以,银黑狐精液低温保存及保存时精子质量的评价就显得非常重要。在我国,研究狐的人工授精开始于20世纪60年代,而冷冻精液的研究是在人工授精
8、工作的基础上于20世纪90年代开始在生产上探索并应用2,其结果远不如象家畜精液冷冻那样拥有一整套完备的成熟技术措施,这是狐属动物在人工饲养条件下繁殖力不高的表现。文献查新表明,稀释液是精子的保护剂,对精液的保存效果起决定性作用。关于银黑狐冷冻稀释液方面的研究报道很少。本选题设计不同稀释液对银黑狐精子低温保存的影响的进行研究,筛选出一种高效低温保存银黑狐精子的稀释液配方,可以提高银黑狐人工授精技术的效率。冷冻精液的应用可进一步提高优良种公狐的配种潜力,可进行种间杂交,可使母狐配种不受时间地域的限制。通过研究不同配方稀释液对银黑狐精液冷冻保存质量的影响3,筛选出一种高效低温保存银黑狐精子的稀释液配
9、方,可以提高银黑狐人工授精技术的效率4,获得更大的经济效益。为普及银黑狐的冷配提供科学依据,对发展我国养狐业集约化、科学化和规范化饲养具有极其重要的意义。本研究对银黑狐精液用伊利尼变温液(IVT) 、氨基乙酸、卵黄牛奶、葡萄糖卵黄4种低温稀释液稀释保存,在05保存5d的过程中对精子的质量从活率、质膜的完整性、顶体的完整性进行了检测。利用伊红苯胺黑检测精子的活率;利用低渗肿胀实验检测精子质膜的完整性;利用考马斯亮蓝染色检测精子顶体的状态5。为探讨行之有效的精液低温保存的稀释液配方,提高银黑狐人工授精技术的效率提供依据。1 材料与方法稀释液是精子的保护剂,对精液的保存效果起决定性作用。一般的稀释液
10、由糖类、蛋白质、脂类、缓冲液、保护剂和其他添加物质组成。动物精液种类不同,所用方法不同其稀释液的组成也不同。本试验选用伊利尼变温液(IVT)、氨基乙酸、卵黄牛奶、葡萄糖卵黄4种稀释液对银黑狐精液进行低温保存,从精子活率、质膜完整性、顶体状态3个方面对精子质量进行检测,旨在筛选出一种高效低温保存银黑狐精子的稀释液配方,为普及银黑狐的冷配提供理论依据。1.1 材料1.1.1 试验动物试验动物为12岁的健康种银黑狐5只,均为雄性。1.1.2 试验地点精液采集于2012年2月至3月在吉林市左家狐场。稀释液配制及试验样品测试在吉林农业科技学院动物繁殖实验室完成。1.2 精液的采集采用手握法采精,将公狐固
11、定于采精架上,呈站立姿势,待其安静后,用42 0. 1 %的高锰酸钾水对阴茎及其周围部位进行消毒。然后,用右手拇指、食指和中指握阴茎龟头尖端,上下轻轻滑动,待阴茎稍有突起时将阴茎由公狐两后腿间拉向后方,上下按摩数次,约2030 s,公狐即可产生射精反射,左手持集精杯随时准备接取精液。然后对鲜精液进行品质检查6,选取活力在0.8以上,密度在10 x 108个/ mL以上的精液用于冷冻7。1.3 精液的稀释保存1.3.1 稀释液配方试验选用IVT、氨基乙酸、卵黄牛奶、葡萄糖卵黄4种稀释液,4种稀释液配方见表1-18。 表1-1 银黑狐精液低温保存稀释液成分(每100 mL)成分稀释液配方IVT氨基
12、乙酸卵黄牛奶葡萄糖卵黄柠檬酸钠/g2.000.72碳酸氢钠/g0.21氯化钾/g0.04葡萄糖/g0.305.50氨苯磺胺/g0.30氨基乙酸/g1.82乳糖/g1.00蔗糖/g0.16奶粉/g0.40甘油/g5.00卵黄/mL10.005.0020.0020.00链霉素/万 IU10101010青霉素/万 IU101010101.3.2 精液的稀释稀释液均为实验当日新配制,试验前将四种稀释液作37水溶同温处理,选取活力在0.8、密度在10 x 108个/ mL以上的精液,与预热好的稀释液,以精液:稀释液=1:2(体积)的比例稀释9。1.3.3 精液的保存将IVT、氨基乙酸、卵黄牛奶、葡萄糖卵
13、黄4种稀释液稀释在35 冰箱内平衡2 h。用铝盒盖距液氮面1 cm左右,在-80-100下滴冻,1 mL精液滴冻101粒,冻后取出冻精检查精子活力后,再放入纱布袋内浸入液氮罐保存。将稀释后的4份精液分别在0,2,4,8,12h及1,2,3,4,5d取出适量的精液,放入37 的恒温水浴中升温处理,升温后的精子用伊红苯胺黑染色、低渗肿胀试验和考马斯亮蓝染色进行质量评价。1.4 精液品质评价1.4.1 精子活率的检测子活率的检测将染色液伊红(5%)、苯胺黑(1%)按1:1混合,37 预热。取少量稀释后的精液与染色液迅速混合,制成抹片自然干燥,显微镜下观察,死精子为红色,活精子不着色或只在头部的核环处
14、呈淡红色。随机观察200个精子并计算出死活精子的比例。1.4.2 质膜完整性的检测 取l mL低渗液于集精杯中,37预热5 min,取稀释后的精液0.1 mL加入预热的低渗液中,37孵育30 min。在高倍镜下计数200个精子,数出精子尾部出现肿胀的百分率。1.4.3 顶体状态的检测取80 L精子稀释液置于1 mL生理盐水中,10 000 r/min离心15s,弃上清液,取沉淀加1 mL3.7%多聚甲醛和磷酸盐缓冲液(PBS)后,用加样器悬浮,室温固定30 min,离心,弃上清液,取沉淀用1 mL PBS悬浮,离心,弃上清液,取沉淀用500800 L PBS悬浮,涂片干燥,0.22%考马斯亮蓝
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