Immunhisprotocol.doc
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1、一、 免疫细胞化学技术的概述*免疫细胞化学(immunocytochemistry, ICC)-是利用抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定细胞内抗原的成分(主要是多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究,称为免疫细胞化学。(一) 对抗原和抗体的要求*具有特异性高和亲和力强的抗体是实验成功的首要条件。-对抗体的要求:纯度高、比活性强;*高度特异性抗体的获得,取决于抗原的纯度。-对抗原的要求:纯度高,免疫原性强,稳定无变化。(二) 抗原 (antigen, Ag)*抗原的概念:凡是在机体内引起体液免疫和(或)细胞免疫反应的物
2、质,称为抗原。抗原具有两个方面的特性:-免疫原性:引起机体产生抗体和(或)致敏淋细胞的特性;-免疫反应性:抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。*根据抗原是否显示免疫原性分为:完全抗原:分子量较大,一般在10kDa以上,并具有较复杂的化学组成。(免疫原性最强的是蛋白质抗原,多糖次之;脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性) 半抗原:又称为不完全抗原,分子量较小。例如:某些短肽、多糖、类脂和药物等。(半抗原必需与载体结合,才能获得免疫原性)。载 体通常是具有高度免疫原性的大分子物质,具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。-常用的载体有钥孔血蓝蛋白(key
3、hole limpet hemocyanin,KLH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin,OVA)等。-用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团-NH2、-COOH等将半抗原结合到载体上。结合比例为5kDa结合525个分子的小肽。(三)抗体 (antibody, Ab)1、抗体的概念:*机体受到抗原刺激后,由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白,被称为抗体。-抗体主要存在于血清内;抗体都是免疫球蛋白,但免疫球蛋白并不一定都是抗体。-免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种,既IgG、 IgD、IgE、
4、IgA、IgM。2、免疫组化实验中常用的抗体:单克隆抗体和多克隆抗体。*单克隆抗体:是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体,是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的。-特异性强、抗体产量高。*多克隆抗体:是将纯化后的抗原直接免疫动物后,从动物血中所获得的免疫血清,是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。-特异性低,会产生抗体的交叉反应。-多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片,可减少假阴性染色机会。-抗原与抗体的结合,要求量保持一定比例,当抗原或抗体过量时,是不能聚合成大颗粒。3、抗体的制备多克隆抗体的制备*动物的选择*佐剂(adjuvant)*免疫方法*免疫剂量*抗体效价的测定*放血或定期抽血 (1)
5、动物的选择选择什么动物来免疫取决于:所需抗血清的量 :小鼠只能提供1.01.5ml的血液,而山羊能提供几升。能供免疫用的抗原量 :小鼠50&61549;g足够,而山羊需要几毫克。动物的品系:免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好。例如哺乳动物的抗原可选择非哺乳动物来制备抗体。常用的动物有兔、羊、马、猪等,以兔(新西兰兔,年轻,健壮,体重在2.5kg左右,雄性)为最常用。(2) 佐剂 (adjuvant)*一般可溶性抗原注射后,迅速从注射部位扩散、吸收代谢。佐剂可延长潴留时间,且延长免疫刺激作用。因此在制备抗体的过程中,常将抗原和佐剂一起注射。 *最常用的佐剂是弗氏佐剂,又分为弗氏不完全
6、佐剂(Freunds incomplete adjuvant) ;弗氏完全佐剂(Freunds complete adjuvant)弗氏不完全佐剂(Freunds incomplete adjuvant, FIA)是由油剂(石蜡油或植物油)与乳化剂(羊毛脂或Tween80)混合而成,比例为1:1、2:1、3:1或5:1,可根据需要而定,通常2:1。(使用时与水溶性抗原按1:1比例充分混合,使抗原分散在佐剂中形成油包水乳剂) 弗氏完全佐剂 (Freunds complete adjuvant, FCA)是在弗氏不完全佐剂中加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌(终浓度为220mg/ml),即成为FCA。
7、*免疫动物时,将弗氏佐剂与抗原按体积 1:1 混合乳化后(油包水)注入动物。-一般首次注射时用完全佐剂乳化,第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。一. 佐剂与抗原乳化的方法:*研磨法(适于制备大量的佐剂抗原):先将不完全佐剂加热,取1.73ml放人无菌玻璃研钵内;缓缓滴入0.23ml活卡介苗,边滴边按同一方向研磨,使菌体完全分散。按同样方法滴人抗原,每加一滴应研磨至小滴消失。滴加抗原的速度要慢,待抗原全部加人后,应成为乳白色粘稠的油包水乳剂。缺点:研钵壁上粘附大量乳剂,抗原损失较大,对微量或难得抗原不宜采用。*注射器混合法: 将等量的完全佐剂和抗原分别吸人两个5ml注射器内,然后插入三通
8、管内,交替推动针管混匀,往复操作直至形成粘稠的乳剂为止。优点:无菌操作,节省抗原或佐剂。缺点:不易乳化,时间长。*快速乳化法:利用超声波粉碎器可快速乳化抗原和佐剂混合物。-将抗原和佐剂按所需量加入一离心管中,置于超声波粉碎器上,粉碎头浸入液面下 0.5cm,离瓶底0.5cm左右,以免打碎离心管。-每次乳化 1015s,然后置冰箱lmin左右。反复乳化34次即可完全乳化。管内残余量800r/min离心510min收集。优点:简单、快速、节省材料。乳化剂的鉴定-判断乳化是否充分,可将一滴乳化好的液体滴在水面上(冷水中),如能长时间保持圆珠形而不散开,表示乳化达到要求。(3) 免疫方法免疫途径*常有
9、静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内、淋巴结、脚掌等注射。*一般采用多点注射方法-常在足、掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处的皮内或皮下。-皮内易引起细胞免疫反应,有利于提高抗体的效价。*几点说明:-大动物一般不用腹腔注射-颗粒抗原和使用佐剂时不能静脉注射-抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法,只需10100&61549;g抗原即可获得较好的免疫效果。-皮内注射较困难,特别是天冷时更难注入。 (3) 免疫方法次数及间隔时间*次数一般为23次(初次免疫和加强免疫)-首次注射后,1015天再加强注射;-剂量同首次或为首次的一半,用不全佐剂或不用佐剂。*间隔时间,一般而言,动物越大,间隔越长-豚鼠、大
10、鼠为78天,兔子为1015天,羊为1428天;-第三次注射的间隔时间更长些,效果更好。举例1:家兔的免疫 *初次免疫-用50200&61549;g Ag加入FCA,在背部皮下注射68点,每点0.10.2ml,也可肌肉内或皮内注射;*两周后,加强免疫-将50200&61549;g Ag于PBS或FIA中,在肌肉、皮下、静脉或腹腔内注射;*抗体效价的检测:加强免疫一周后,耳缘静脉采血-抗体效价测定可用环状沉淀试验、琼脂双向扩散法等方法。前者抗体效价在1:4000以上,后者在1:16以上,即可采血,取血清进一步提纯。举例2:微量抗原淋巴结内注射免疫家兔*一般选择2.53.0kg的新西兰种公兔-先在其
11、两脚垫注射完全福氏佐剂0.2ml(卡介苗每兔合5mg);-10天后,见胭窝淋巴结肿大,然后将抗原注射至肿大的淋巴结内,第一次注射抗原用完全福氏佐剂混合乳化;-以后每隔20天用不完全福氏佐剂乳化抗原,以同样方法加强2次,各次注射的抗原均为2550&61549;g;-末次注射两周后兔耳放血测价 (可达1:128)。举例3:豚鼠和大鼠的免疫 *初次免疫-用10100&61549;g Ag加入FCA,在背部皮内注射46点,每点 0.lml,也可肌肉内或皮下注射;*加强免疫-每隔 78天,将1050&61549;g Ag于 PBS或FIA中。在肌肉、皮下或静脉注射;(4) 免疫剂量*抗原性强的抗原量应小
12、,过大反会引起免疫抑制;*免疫周期长的动物可少量多次注射,短的可大量少次。*各种动物首次免疫抗原剂量和加强免疫的剂量(5) 抗体效价的检测多采免疫双向扩散法 一【基本原理】*指抗原和抗体在同一凝胶内都扩散,彼此相遇后形成特异性的沉淀线。-将抗原与抗体分别加入同一凝胶板中两个相隔一定间距的小孔内,使两者进行相互扩散,当抗原抗体浓度之比相适宜时,彼此相遇形成一白色弧状沉淀线。*优缺点:简便,但敏感性较低,易出现假阴性结果。1. 免疫双向扩散法的操作步骤:*将玻璃板用水洗净后用75乙醇冲洗,晾干后放在水平台上备用。*将1agar 融化后,置56水浴。*在玻璃板上铺胶,约1.5mm 厚,凝固后打孔(直
13、径 3rnm),孔间距10mm。*中心孔加5&61549;l 抗原样品,周围孔内每孔加5&61549;l 抗血清(抗体预先作系列倍比稀释即 1:2、1:4、1:8、1:16、1:32等比例)。*凝胶板置湿盒内,室温扩散24h。*观察结果。2. 抗体效价检测的其它方法*环状沉淀试验,需较多的抗血清,现已很少用;*对流免疫电泳,比琼脂免疫双扩散法敏感,较简便、实用;*酶联免疫吸附试验 (ELISA)。3放血或定期抽血 常用以下3种方法*颈动脉放血法:放血量较多,动物不易中途死亡。例如:2.5kg白兔可放血约80ml。家兔、山羊、绵羊等动物采血常用此法。*心脏采血法:常用于家兔、豚鼠、大白鼠、鸡等小
14、动物,但操作不当易引起动物死亡。*静脉采血:家兔可用耳缘静脉采血;山羊、绵羊、马和驴可用颈静脉采血,这种放血法可隔日1次,有时可采集多量血液。注意:采血过程中,动作要轻柔,尽量避免溶血;血液凝固后,及时离心收集血清,否则细胞溶解释放的杂蛋白(例如蛋白水解酶)将污染抗体并将抗体水解,降低效价;加叠氮化钠,分装,低温保存,也可加一定的保护剂如BSA、甘油等。二、组织和细胞标本的制备*标本制备恰当,是免疫组化成功的首要条件*免疫组化对组织和细胞标本的要求-保持所检标本原有的结构、形态;-在原位最大程度地保持待测抗原(或抗体)的免疫活性,既不淬灭、流失或弥散,也不被隐蔽。*免疫组化的组织和细胞标本,制
15、作流程与常规处理方法基本相同,但对组织、细胞的处理又有其特殊要求及注意事项。-各种抗原由于其含量及特性的差异对标本处理方式常有不同要求,因此要选择适用于本实验的最佳方法。免疫组化中常用的组织和细胞标本*组织标本 -石蜡切片 -冰冻切片*细胞标本 -组织印片 -细胞培养片(细胞爬片) -细胞涂片(一) 石蜡切片*石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法-最大优点是组织形态保存好,且能作连续切片,有利于各种染色对照观察;-石蜡块还能长期存档,供回顾研究。*石蜡切片制作过程对组织内抗原显现有一定的影响,但可通过某些措施予以改善,因而它是大多数免疫组化中首选的组织标本制作方法。1、取材的特殊要求及注
16、意事项*标本新鲜:一般在2h以内进行,超过2h,组织将有不同程度的自溶,其抗原或变性消失,或严重弥散。*取材部位:除取病灶或含待检抗原部位外,还应取病灶与正常交界处,即所取组织切片中同时应有抗原阳性和阴性区,以形成自身对照。-细胞坏死后,不仅抗原弥散或消失,而且常引起非特异着色,干扰观察,因此取材时应尽可能避开坏死区。*避免挤压:取材时组织受挤压可使边缘部细胞形态改变并加深非特异着色,因而取材时应使用锋利的刀刃;镊取组织动作要轻;经窥镜直接钳取的组织往往有过度挤压,观察结果时应有所考虑。2、固定及常用的固定液*取材后的组织需立刻投于固定剂中-固定使组织和细胞的蛋白质凝固,终止内源性或外源性酶反
17、应,防止组织自溶或异溶,以保持原有结构和形态;对免疫组化而言更有原位保存抗原的作用,避免抗原失活或弥散。*常用固定液:固定剂品种很多,但大多属于醛类和醇类。其固定原理不同,各有优缺点。-醛类(常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛)-醇类(常用乙醇)-其它 (丙酮)(1) 醛类*甲醛(福尔马林)应用最广-原理:形成分子间的交联,影响蛋白构型而使之固定。-优点:形态结构保存好,且穿透性强,组织收缩少。-缺点:甲醛放置过久可氧化为甲酸,使溶液pH降低,影响染色;醛基与抗原蛋白的氨基交联形成羧甲基,使抗原决定簇的三维构象出现空间障碍;分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇,使之不能充分暴露。可
18、造成假阴性的染色结果。 -注意事项:缩短固定时间,降低固定温度(4&61616;C),为此组织块不宜过厚。改用中性缓冲福尔马林,以pH值7.27.4 0.01mol/L的磷酸盐缓冲液配制成10甲醛固定液,减少固定液pH的变化。*固定后充分水洗以减少分子间交联。*切片在作免疫组化染色前,先经预处理使抗原再现(抗原修复)。*戊二醛:穿透性强,微细结构保存好,但对抗原有一定影响,常与其他固定剂联合用作免疫电镜固定液。*多聚甲醛(常用4%):可用于免疫电镜;也可用于免疫荧光染色。主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原,例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等。(2) 醇类*
19、 最常用的醇类固定剂是乙醇。固定作用:使细胞内蛋白、糖类发生沉淀。优点:穿透性强、抗原性保存好。缺点:脱水性强,易引起组织收缩、变硬,影响切片质量,因而乙醇固定时间不宜过长(2h内);乙醇使蛋白变性的作用轻,固定后可再溶解;染色过程中,温育时间长,抗原可流失而减弱反应强度。(3) 其它固定剂*丙酮:对抗原性的保存好,但脱水性更强,较少 用于组织标本,但细胞爬片常用丙酮固定。3、抗原修复原因*常规的石蜡切片标本均用甲醛固定,结果使得:-抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇;-蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。*要求:在染色时,需要先进行抗原修复或暴露,即将固定时分子之间所形成的交
20、联破坏,而恢复抗原的原有空间形态。3、抗原修复方法*修复液: -最常用的是pH6.0的0.01mol/L的枸橼酸盐缓冲液; -最新研究表明碱性修复液更有效,推荐使用1mM的EDTA缓冲液(pH8.0)。方法:*化学方法*加热方法:水浴加热法;微波照射法;高压加热法;酸水解法(1) 化学方法*主要是通过一些酶的作用,使抗原决定簇暴露。常用的酶有:胰蛋白酶、胃蛋白酶等。-胰蛋白酶:一般使用浓度为0.050.1,消化时间为37,1040min,主要用于细胞内抗原的显示;-胃蛋白酶:一般使用浓度为0.1%0.4,消化时间为37、30180min,主要用于细胞间质抗原的显示。*例如:Laminin、Co
21、llagenIV(2) 水浴加热法*将玻片放入装有抗原修复液的容器中,加热至沸腾,持续1015分钟。-优点:操作简单、经济,适用于所有的实验室,-缺点:对封闭牢固的抗原决定簇暴露不理想。(3) 微波照射法*将玻片放入装有抗原修复液的容器中,置微波炉加热至95以上,持续l015分钟,冷却后,按免疫组化染色步骤进行。*此方法由于微波场内极性分子、离子高速运动,撞击交联的网链,使抗原异常的构想恢复正常,且因分子运动产热、效率高、时间短,对抗原再现效果好。(4) 高压加热法暴露抗原*将玻片浸入抗原修复液内,置高压锅中高压23min,可取得极好的效果。*由于高压下受热均匀,特别使用于大批量标本的染色。(
22、5) 酸水解法*酸水解可使交联断裂、暴露抗原。*将玻片浸入1mol/L HCl 溶液中,室温作用20min(温度升高,作用时间缩短)。*此法能增强特异性染色,降低背景,但需注意水解过度将破坏抗原性及形态结构。加热法的注意事项 :达到规定的温度(9295以上);维持一定的时间;避免切片干涸 (抗原可能完全丢失);加热后必须经过室温自然冷却2030分钟,使未折叠的蛋白分子链恢复天然构型;4、载玻片的处理*抗原修复过程中,由于高温、高压等诸多固素的影响,极易造成脱片。为防止脱片,常用粘附剂处理载玻片。-新载玻片上有油污,要用洗液浸泡1224h,自来水冲洗后再用蒸馏水清洗;用绸布擦干或烤箱烤干。清洁的
23、载玻片再用粘附剂处理。*常用的粘附剂有:-APES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)-Polv-L-Lysine(多聚赖氨酸)-铬明胶溶液(1).3-氨丙基三乙氧基硅烷APES(3-aminopropyltriethoxysilane )*现用现配。用纯丙酮或甲醇配制2%APES(v/v);*将洗净的玻片浸于此液中2030秒钟;*取出稍停片刻,再入纯丙酮酮溶液洗去未结合的APES,置通风橱中晾干或60烤箱烤干。(2)Polv-L-Lysine (多聚赖氨酸)*将清洁玻片浸于100&61549;g/ml(10%w/v)的多聚赖氨酸溶液中(去离子水稀释),37放置30min,然后60烤箱烘烤1h或室温过夜
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