PCR技术的基本原理.doc
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1、PCR技术的基本原理:该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下,依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板,借助一小段双链DNA来启动合成,通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合,形成部分双链。在适宜的温度和环境下,DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3-OH末端,并以此为起始点,沿模板53方向延伸,合成一条新的DNA互补链。PCR目录 PCR原理 PCR反应体系与反应条件 PCR步骤 PCR检测 PCR反应特点 PCR仪器 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction),简称PCR,是一种分子生物学技术,
2、用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。 DNA聚合酶(DNA polymerase I)最早于1955年发现 ,而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现,但由于此酶不耐高温,高温能使之变性, 因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称 Taq polymerase), 则是于1976年从 温泉中的细菌(Thermus aquaticus)分离出来的。它的特性就在于能耐高温,是一个很理想的 酶,但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复
3、复制,它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制(类似PCR前两个周期反应)的实验。而现今所发展出来的PCR则于1983由 Dr. Kary B. Mullis发展出的,Dr. Mullis当年服务于PE公司,因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年与 Saiki 等人正式表了第一篇相关的论文。此后,PCR的运用一日千里,相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用,成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。编辑
4、本段PCR原理 DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链,在DNA聚合酶与启动子的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,并设计引物做启动子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 但是,DNA聚合酶在高温时会失活,因此,每次循环都得加入新的DNA聚合酶,不仅操作烦琐,而且价格昂贵,制约了PCR技术的应用和发展。 发现耐热DNA聚合同酶-Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义,该酶可以耐受90以
5、上的高温而不失活,不需要每个循环加酶,使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本,PCR技术得以大量应用,并逐步应用于临床。 PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成:模板DNA的变性:模板DNA经加热至93左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;引物的延伸:DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚
6、合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟, 23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。编辑本段PCR反应体系与反应条件 标准的PCR反应体系: 10扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul PCR反应五要素: 参加PCR反应
7、的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg2+)编辑本段PCR步骤 标准的PCR过程分为三步: 1.DNA变性(90-96):双链DNA模板在热作用下, 氢键断裂,形成单链DNA 2.退火(25-65):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。 3.延伸(70-75):在Taq酶(在72左右最佳的活性)的作用下,以dNTP为原料,从引物的5端3端延伸,合成与模板互补的DNA链。 每一循环经过变性、退火和延伸,DNA含量既增加一倍。如图所示: 现在有些PCR因为扩增区很短,即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成,因此可以改为两步法,即退火和延伸同时在6
8、0-65间进行,以减少一次升降温过程,提高了反应速度。编辑本段PCR检测 PCR反应扩增出了高的拷贝数,下一步检测就成了关键。荧光素(溴化乙锭,EB)染色凝胶电泳是最最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的,因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行,成为了主流检测方法。近年来以荧光探针为代表的检测方法,有逐渐取代电泳法的趋势。编辑本段PCR反应特点 特异性强 PCR反应的特异性决定因素为: 引物与模板DNA特异正确的结合; 碱基配对原则; Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性; 靶基因的特异性与保守性。 其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸
9、是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性,使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行,结合的特异性大大增加,被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区,其特异性程度就更高。 灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的,能将皮克(pg=10- 12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞;在病毒的检测中,PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位);在细菌学中最小检出率为3个细菌。 简便、快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在DN
10、A扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应,一般在24 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析,不一定要用同位素,无放射性污染、易推广。 对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。 PCR的循环参数 1、预变性(Initial denaturation) 模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要,一般95加热3-5分钟。 2、引物退火(Primer annealing) 退火温度一般需要凭实验(经验)决定。 退火温度对PCR的特异性有较大影响。 3、引物延伸 引物延
11、伸一般在72进行(Taq酶最适温度)。 延伸时间随扩增片段长短而定。 4、循环中的变性步骤 循环中一般95,30秒足以使各种靶DNA序列完全变性: 变性时间过长损害酶活性,过短靶序列变性不彻底,易造成扩增失败。 5、循环数 大多数PCR含25-35循环,过多易产生非特异扩增。 6、最后延伸 在最后一个循环后,反应在72维持5-15分钟使引物延伸完全,并使单链产物退火成双链。 (四)PCR中的污染和假阳性 PCR中污染主要来自 1、样品间交叉污染; 2、先前PCR产物遗留(carry-over)编辑本段PCR仪器 pcr仪器的发展 pcr温度循环至关重要,pcr扩增仪各参数必须准确。自perki
12、n elmer cetus公司第一台pcr扩增仪问世以来,现已有几十家不同的厂家在国内外生产和销售pcr扩增仪。在短短的几年间,扩增仪经过几代的发展,不断采用新技术,并且进一步朝方便、实用、高智能化和自动化的方向发展。 为了便于了解和选购适宜的pcr实验设备,现将部分国内外pcr扩增仪列表如下(表22-5);这些仪器主要用变温铝块、变温水浴及变温气流的方式达到热循环的目的,各有其优缺点。国产1109型dna扩增仪则是用恒温浴机械手移位式。更接近于手工操作。ptc-51a/b体积小,智能化与自动化程序高,可以兼做套式pcr,方便实用。以上各种仪器一般都配有微电脑自动控制温度、时间及循环数,可以达
13、到节 省劳动力的目的。在采用这些仪器作pcr试验之前,一般均应实测管内温度变化循环情况,以了解升、降温时管内因热传导造成的温度滞后情况和实际到达的最高、最低温度,用于修正设计的循环参数。温度滞后受到所用eppendorf管材料、壁厚及形状(与铝块孔匹配程度)的影响,这对变温铝块式仪器影响更大些。对于配用制冷机式半导体元件致冷的仪器,在使用低于室温的温度来保冷pcr反应后小管时,应注意冷凝水的问题,勿使流入仪器内浸湿半导体元件而损坏仪器。 国内外生产的几种dna扩增仪 1109型 北京新技术所与军科院联合 机械臂 变温水浴 电子调温 400.5ml 16400元/台 90a/b型 中科院遗传所
14、机械臂 变温水浴 电热 14000元/台 ptc-51a/b型 军事医学科学院 变温气流 电子调兼作套式 300.5ml 12000元/台 dna thermal cycler perkin elmercetus(美) 变温铝块 压缩机致冷 480.5ml us $ 20000.- thermocycler 60 00 180 b.braun biotech (德) 变温水浴98四档 电热,自来水冷却 601.5ml 1001.5ml 1801.5ml dm 30000.- automatic temperature cy-cler single block twin block ericom
15、p inc.(美) 变温铝块25100 电热,自来水冷却 291.5ml 581.5ml us $4985.- us $7980.- grant autogen grant instrumant ltd(美) 变温水浴099 电热,自来水冷却或加冷循环器 501.5ml or 501.5ml us $250. plus us $ 15.-for rack(x2) techne phc-1 phc-2 techne ltd.(英) 变温铝块099三档 电热500w水冷100w 540.5ml 540.5ml 241.5ml 3383. 3997. - biooven biothrm corp(美
16、) 变温气流 -150 115v 11a 200s of 496plate us $ 2990. - trio-thermo-block tb-1 biomertra(德) 半导体变温 220v 320管 分别控温 dm12900. - micro cycler e eppendorf(美) 变温铝块 220v/100v 329管 us $ 3500. - PCR常见问题 PCR产物的电泳检测时间 一般为48h以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型不规则甚致消失。 假阴性,不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有模板核酸的制备,引物的质量与特异性,酶的质量及, PCR循环条件。寻找原因亦
17、应针对上述环节进行分析研究。 模板:模板中含有杂蛋白质,模板中含有Taq酶抑制剂,模板中蛋白质没有消 化除净,特别是染色体中的组蛋白,在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处 理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应 固定不宜随意更改。 酶失活:需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 引物:引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有
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