SDS-PAGE.doc
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1、生物学综合实验论文题目双向电泳作者姓名学号所在院系生命科学学院学科专业名称生物科学导师邵锦震 论文完成时间2013年7月30日 摘 要:双向电泳技术是分离大量蛋白质组分的最有效的方法。1975年OFarrells首次建立了等电聚焦(IEF)及SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)双向电泳技术(2-D),并成功地分离约1000个E.coli蛋白。该方法依赖于蛋白质的两个重要特性:分子量和等电点。利用这一性质首先通过毛细管聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦技术将不同等电点的蛋白质分开,然后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳将相同或相近等电点而分子量不同的蛋白质进行相对分子量分离。经过电荷和质量两次分离后,可以得到
2、蛋白质分子的等电点和分子量信息。第一向IEF/SDS-PAGE所用的聚丙烯酰胺凝胶通常为柱状,第二向SDS-PAGE所用的为板状。IEF/SDS-PAGE与IEF-PAGE和SDS-PAGE的区别在于: 1. 第一向的电泳分离系统与相应的单向电泳不同。在进行第一向IEF-PAGE时,为保证被分离的各种蛋白质能够充分地与SDS结合以利于第二向SDS-PAGE的进一步分离,必须在第一向电泳系统内加入高浓度的尿素和适量的的非离子去污剂NP-40,而且溶解蛋白质样品的溶液中除了加入这两种试剂外还含有二硫苏糖醇(DTT)。这些试剂本身并不带电荷,不影响各蛋白质原有的电荷量和等电点,其作用在于破坏蛋白质分
3、子内的二硫键,促使蛋白质变性和肽链舒展,从而有利于蛋白质分子在较为温和的条件下与SDS充分结合。2. 第二向的加样操作与相应的单向电泳不同。经过第一向IEF-PAGE,蛋白质在第一向的凝胶柱内得到了初步的分离。在进行第二向SDS-PAG时,其加样方式是将第一向电泳后的凝胶柱包埋在第二向的凝胶板内,通常包埋于凝胶板的上端。由于第二向的电泳分离系统不同于第一向,因此必须将第一向电泳后的凝胶柱在包埋于第二向凝胶板之前,预先在第二向的电泳分离系统内进行震荡平衡。所用的平衡液通常与单向SDS-PAG所用的蛋白质样品处理液相一致,内含b-巯基乙醇和SDS等。经过震荡平衡,凝胶柱内原有的第一向分离系统被第二
4、向的电泳分离系统所取代。其中b-巯基乙醇使蛋白质组分分子的二硫键保持还原状态,有利于SDS与蛋白质充分结合,从而完成第二向SDS-PAGE的样品处理,即可进行第二向电泳。要使聚丙烯酰胺双向电泳能够得到较为精确的分离结果,组成双向电泳的两个单向电泳所依据的分离原理应该有很大的不同。以蛋白质混合组分得分离为例,如果两个单向电泳所依据的分离原理相似,那么所得到的双向聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离斑点基本呈对角线分布,这种分离结果并不比单向电泳分离优越。双向电泳技术是目前蛋白质组学研究中最常用的蛋白质分离技术, 具有相吩简便、快速、高分辨率和重复性等优点。目 录 1 前言 .5 1.1第一向电泳等电聚焦IE
5、F原理.5 1.2第二向电泳SDS-PAGE原理.62 材料与方法 . 6 2.1 溶液与试剂 . 7 2.1.1 IEF试剂的配制.7 2.1.2 SDS-PAGE试剂的配制82.2 实验仪器 .122.3 实验方法 .13 2.3.1 双向电泳整个实验流程132.3.2 第一向电泳等电聚焦IEF.152.3.3 第二向电泳SDS-PAGE.163 结果与分析 . 193.1 影响实验结果的一些因素. 19 3.2 催化反应的条件 . .20 3.3 注意事项. 214 参考文献 . 221. 前言。IEF/SDS-PAGE双向电泳法是OFarrall和Klose分别在1975年根据不同组份
6、之间的等电点差异和分子量差异建立的。利用这一性质首先通过毛细管聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦技术将不同等电点的蛋白质分开,然后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳将相同或相近等电点而分子量不同的蛋白质进行相对分子量分离。经过二维电泳分离的蛋白质在二维电泳图谱所处的位置,就是该蛋白质的相对分子量和等电点。1.1等电聚焦电泳(IEF,isoelectric focusing electrophoresis) 利用特殊的一种缓冲液(两性电解质)在凝胶(常用聚丙烯酰胺凝胶)内制造一个pH梯度,电泳时每种蛋白质就将迁移到等于其等电点(pI)的pH处(此时此蛋白质不再带有净的正或负电荷),形成一个很窄的区带pH梯度的组
7、成 pH梯度的建立是在水平板或电泳管正负极间引入等电点彼此接近的一系列两性电解质的混合物,在正极端引入酸液,如硫酸、磷酸或醋酸等,在负极端引入碱液,如氢氧化钠、氨水等。电泳开始前两性电解质的混合物pH为一均值,即各段介质中的pH相等,用pH0表示。电泳开始后,混合物中pH最低的分子,带负电荷最多,pI1为其等电点,向正极移动速度最快,当移动到正极附近的酸液界面时,pH突然下降,甚至接近或稍低于PI1,这一分子不再向前移动而停留在此区域内。由于两性电解质具有一定的缓冲能力,使其周围一定的区域内介质的pH保持在它的等电点范围。pH稍高的第二种两性电解质,其等电点为pI2,也移向正极,由于pI2pI
8、1,因此定位于第一种两性电解质之后,这样,经过一定时间后,具有不同等电点的两性电解质按各自的等电点依次排列,形成了从正极到负极等电点递增,由低到高的线性pH梯度。理想的两性电解质载体应在pI处有足够的缓冲能力及电导,前者保证pH梯度的稳定,后者允许一定的电流通过。不同pI的两性电解质应有相似的电导系数从而使整个体系的电导均匀。两性电解质的分子量要小,易于应用分子筛或透析方法将其与被分离的高分子物质分开,而且不应与被分离物质发生反应或使之变性。 IEF的基本原理在IEF的电泳中,具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极,pH值逐渐增大。如前所述,蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征,这样在碱性区域
9、蛋白质分子带负电荷向阳极移动,直至某一pH位点时失去电荷而停止移动,此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点(pl)。同理,位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动,直到它们的等电点上聚焦为止。可见在该方法中,等电点是蛋白质组分的特性量度,将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中,在电场内经过一定时间后,各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上,形成分离的蛋白质区带。均一胶和线性梯度胶1.2 SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理:由于SDS带有大量负电荷,当其与蛋白质结合时,所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷,因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异,均
10、带有相同密度的负电荷,因而可利用分子量差异将各种蛋白质分开。 在蛋白质溶解液中,加入SDS和巯基乙醇,巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原,使多肽组分分成单个亚单位。 SDS可使蛋白质的氢键、疏水键打断,因此它与蛋白质结合后,还引起蛋白质构象的改变。此复合物的流体力学和光学性质均表明,它们在水溶液中的形状近似雪茄形的长椭圆棒。不同蛋白质-SDS复合物的短轴相同,约1.8nm,而长轴改变则与蛋白质的分子量成正比。基于上述2种情况,蛋白质-SDS复合物在凝胶电泳中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响,而只是与椭圆棒的长度,也就是蛋白质分子量的函数有关。进行SDS-PAGE时,可利用已知分子量蛋
11、白质的电泳迁移率和分子量的对数作出标准曲线,再根据未知蛋白质的电泳迁移率求得分子量。2 材料与方法 2.1 溶液与试剂2.1.1 IEF 溶液配制 (1)覆盖溶液(25 mL/班) 含8 mol/L尿素,1%两性电解质pH 39.5,5% (w/v) NP40(Nonidet P 40 Substitute)和100 mmol/L DTT.药品成分质量/体积尿素12 g两性电解质(pH 39.5)0.25 mL10%的NP4012.5 mLDTT0.386 g重蒸水定容到25mL溶液不能受热,储存在冰箱中。(2)平衡溶液(250 mL/班) Tris-HCl( pH 6.8)缓冲液,含2% S
12、DS,100 mmol/L DTT和10%甘油药品成分质量/体积Tris-HCl(pH 6.8)15 mL10%SDS50 mLDTT3.86 g甘油29 mL重蒸水定容到250mL室温存放。(3) 30% Acrylamide第一向储液(100mL/班) 含28.4% (w/v) acrylamide和1.6% (w/v) N,N-methylene-bis-acrylamide用重蒸水先将bisacrylamide溶解后,再加入acrylamide,溶解,用重蒸水定容到100 mL。药品成分丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺超纯水质量/体积 28.4 g1.6 g100ml如果溶液混浊,需要进行过滤。
13、溶液存放在棕色瓶中,4C贮藏,34星期内使用。(4) 10%(w/v) NP40 配制100 mL溶液,称量10 g NP40,用重蒸水定容到100 mL,室温存放。(5) 20 mmol/L NaOH 配制500 mL,称0.4 g NaOH用蒸馏水定容到500 mL。(6) 10 mmol/L H3PO4 配制2000 mL,量取1.35 mL H3PO4(85%)用蒸馏水定容到2000 mL。(7)固定液 药品成分乙醇三氯乙酸磺基水杨酸蒸馏水质量/体积35mL10 g3.5 g定容到100 mL(8)脱色液 药品成分乙醇冰乙酸蒸馏水质量/体积25 mL10 mL定容到100 mL(9)
14、10%过硫酸铵 0.1 g过硫酸铵溶于1mL重蒸水中,在4C冰箱中可保存34个星期。 2.1.2 SDS-PAGE溶液配制。(1)30% 聚丙烯酰胺贮液药品成分丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺超纯水质量/体积 150g4g500ml滤纸过滤后,棕色瓶4冰箱保存(2)1.5mol/L Tris碱 pH8.8药品成分Tris碱超纯水质量/体积90.75 g400 ml用1mol/L HCl调pH至8.8,加超纯水定容至500ml,4冰箱保存。(3)0.5mol/L Tris碱 pH6.8药品成分Tris碱超纯水质量/体积12 g120 ml用1mol/L HCl调pH至6.8,加超纯水定容至200ml。4冰
15、箱保存。(4)10% SDS药品成分SDS超纯水质量/体积10g100 ml混匀后,室温保存。(5)10% Ap药品成分Ap超纯水质量/体积 0.1g1ml(用时加水溶解)溶解后,4冰箱保存(6)10电泳缓冲液(1= 25mM Tris,192mM glycine,0.1% SDS,pH8.3)药品成分Tris碱甘氨酸SDS超纯水质量/体积30g144g10g1L混匀后,室温保存(7)2SDS-PAGE上样缓冲液药品成分质量/体积0.5M pH6.8 Tris碱2.0ml10% SDS4.0ml甘油2.0ml1% 溴酚蓝0.05ml超纯水 定容至10mlDTT0.154g(用时现加)(8) 固
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