SPA的纯化、表达与鉴定.doc
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1、 SPA的纯化、表达与鉴定中文摘要: 该实验用大肠杆菌做表达载体,然后用IPTG诱导大肠杆菌表达SPA,破碎大肠杆菌提取SPA后用镍柱纯化,再运用SDS-PAGE、双向免疫扩散法、western blotting等方法对表达的蛋白质进行鉴定,其中制备免疫血清(抗SPA免疫血清)选取的动物为雄性健康成年的家兔。中文关键词:SPA、SDS-PAGE、western blotting、双向免疫扩散。前言1. SPA的背景 SPA即(Staphylococcal protein A,SPA)葡萄球菌A蛋白,是葡萄球菌细胞壁的一种表面蛋白(单链多肽),能与人及某些哺乳类动物的IgG分子的Fc段发生非特异
2、性结合,SPA与IgG结合后的复合物具有抗吞噬,促细胞分裂,致超敏反应和损伤血小板等活性.(一)SPA的主要存在部位SPA存在于大多数(90)金黄色葡萄球菌中,而不存在于表皮葡萄球菌中;并且主要存在于血浆凝固酶阳性菌株,而不存在于阴性菌株中。前者是致病的,后者是非致病的,但在体内研究中尚未发现SPA和菌株致病性之间有任何肯定的关系。不同菌株间的SPA含量有明显差异,以I株金黄色葡萄球菌含SPA量最高,和细胞壁的肽聚糖呈共价结合。抗二甲氧基苯青霉素突变株(methicillin-resistant strain)能产生分泌SPA,它较之细胞壁所含的SPA在免疫学性质上相似,但易分离,损失少。(二
3、)SPA的相对分子质量及等电点SPA为蛋白质成分,仅含少量或不含碳水化合物,其相对分子质量因提取方法不同而异,用脱氧核糖核酸酶消化细胞壁后超速离心或用加热抽提法,所测相对分子质量为1200015000。用沉淀平衡分析和在6molL鸟嘌呤盐酸中凝胶过滤,测出相对分子质量为42000。SPA为单链多肽,内含3个高度相似的Fc段结合区,每区由50个以上的氨基酸组成,不含色氨酸和半胱氨酸。其羧基末端是赖氨酸,氨基末端结构尚未肯定。SPA黏度高于球蛋白,等电点(pi)为51,其天然结构十分稳定,在应用6 molL鸟嘌呤盐酸变性剂的条件下,尚能保存某些三级结构,如将变性剂除去,则能自然矫正而恢复原有结构。
4、(三)SPA的免疫学特性SPA具有和人及许多动物(如豚鼠、猪、小鼠、猴等)IgG结合的能力。SPA结合部位是Fc段而不是Fab段,这种结合不会影响抗体的活性。SPA具有的结合力是双价的,每个SPA分子可以同时结合2个IgG分子,也可一方面同IgG相结合,一方面与标记物如荧光素、酶(HRP、AKP和GO等)、胶体金和铁蛋白等相结合。还有一个饶有兴趣的事实是,与SPA结合后IgG可用4molL鸟嘌呤盐酸等使之解离。利用这一生物化学特性,可以将SPA交联在葡聚糖凝胶上,对抗原或抗体蛋白质进行纯化。SPA对IgG免疫球蛋白亚型的结合有选择性,如SPA与人IgG亚型IgGl、IgGz和IgG4有结合力,
5、唯独不结合IgG3;只结合IgH2,而不结合IgHl。SPA与人及大部分哺乳动物血清中的IgG结合,能反应的动物包括豚鼠、小鼠(纯种)、狗、猪、猴和经免疫的家兔等。其结合部位为免疫球蛋白的CH2和Cn3的交界处。另外,它还能与少数血清中的IgM结合。SPA还能激活和固定补体,激活B淋巴细胞,促使其成熟并分泌产生各类免疫球蛋白。(四)SPA的生物学特性 1免疫原性与过敏原性:SPA做为免疫原能刺激免疫活性细胞合成Ig,又能与其相应抗体的Fab段结合呈现抗原抗体的特异性反应。SPAIgG注射家兔皮下可引起Arthus样反应,还可引起豚鼠的迟发性超敏反应。SPA体外试验,能刺激豚鼠离体回肠收缩。 2
6、抗吞噬作用:由于IgG的Fc段结合点既是lgG调理活性结合点,又是SPA反应点。因此,SPA可与吞噬细胞竞争,结果抑制了多形核白细胞的吞噬作用,也可能是SPA阻断调理素与吞噬细胞作用的结果。 3固定补体:SPAIgG和免疫复合物一样可以固定人和某些动物(如豚鼠、猪、狗等)血清中的补体,主要是通过补体传统激活途径。 4促有丝分裂因子:SPA是一种B细胞激活剂,固相SPA作用明显,并不需要T细胞辅助,可容性SPA作用微弱,必须有T细胞参与。 5去封闭作用:固相SPA能部分去除肿瘤病人和带瘤动物血清中的封闭活性,从而降低了血清对淋巴细胞介导的细胞毒的封闭作用。 (五)SPA的应用1应用于免疫球蛋白的
7、制备和分析:SPA是一种比较理想的提纯和分析免疫球蛋白的试剂。由于SPA与IgG及其某些亚型的Fc段有较强的结合力,可利用来提纯、分析免疫球蛋白制剂,结合后的PSAIgG可再用解离剂如4mol/L尿素、4mol/L,硫氰酸盐或6mol/L的鸟嘌呤盐酸盐使之解离,多用SPASepharose 层析柱分离IgG或其亚型及断片如Fc、Fab等。2应用于免疫细胞化学:由于SPA具有双价结合力,在免疫细胞化学技术中可作为桥抗体或标记抗体。由于SPA能与多种动物的IgG的Fc段结合,因此,作为第二抗体或标记抗体,SPA的最大优点是不受种属特异性的限制,故在目前各种免疫细胞化学技术中已得到广泛的应用。除不受
8、种属限制这一特点外,SPA法还具有染色时间短、灵敏性高和背景染色淡等优点。据报告用国产酶联SPA代替酶标记抗体,应用间接染色,时间较PAP法省时一半。SPA分子量小(1300042000),易于穿透组织,而免疫球蛋白酶标记抗体为200000,PAP复合物为430000,均较SPA分子量大。3应用于多种细菌、支原体和病毒等病原体的简易快速诊断可应用SPA菌体作为载体,结合特异性抗体成为一种吸附原,作协同凝集剂,用于某些细菌和病毒的定群和分型。4可作为一种研究免疫复合物、膜抗原、膜受体和膜Ig的固相吸附剂Hallgsen用同位素标记SPA测定血IgG的凝集物,发现85%全身性红斑狼疮和42%类风湿
9、病人血清中凝集物增高。SPA用于细胞膜抗原、表面IgG和Fc受体的研究最大特点是能研究活细菌。Ghetie(1976)用SPA致敏绵羊红血球,与经IgG处理的细胞形成玫瑰花环,来鉴定带Fc受体的细胞,反之,如用SPA抑制玫瑰花环形成,则可定量测定细胞表面的IgG。应用SPA与胶体金或铁蛋白相结合,可在电镜水平检查抗原抗体反应的定位。特别是蛋白A胶体金技术(Protein AGold technique, PGA技术)自Pomano和Romano(1977)首次报告用于标记细胞表面抗原、包括淋巴细胞、血小板、大鼠肾脏细胞及感染的病毒细胞获得成功以后,已得到愈来愈广泛的应用,是一种较为理想的免疫电
10、镜技术。实验原理1 SPA的原核表达大肠杆菌表达的基本概念:一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株,如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂,如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag检测等等。选择表达系统通常要根据实验目的来考虑,比如表达量高低,目标蛋白的活性,表达产物的纯化方法等等。主要归结在表达载体的选择上。表达载体:我们关心的质粒上的元件包括启动子,多克隆位点,终止密码,融合Tag(如果有的话),复制子,筛选标记/报告基因等。通常,载体很贵,我们可以通过实验室之间交换得到免费的载体。但是要小心,辗转多个实验室和多个实验室成员之手的载体是否保持原来的遗传背景?MCS是否还是原来那个MCS
11、?是我们要特别注意的。E.coli的乳糖操纵子(元)含Z、Y及A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白,后者与O序列结合,使操纵子(元)受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解(代谢)物基因激活蛋白(CAP)结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控区调节,实现基因产物的协调表达 。在没有乳糖存在时,lac操纵子(元)处于阻遏状态。此时,I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合,阻碍RNA聚合酶与P序列结合,抑制转录
12、起动。当有乳糖存在时,lac操纵子(元)即可被诱导。在这个操纵子(元)体系中,真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞,经b半乳糖苷酶催化,转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白,使蛋白构象变化,导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。 T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系,利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。T7噬菌体基因编码的T7 RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。它是一种高活性的RNA聚合酶,其合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。
13、并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。在细胞中存在T7 RNA聚合酶和T7噬菌体启动子的情形下,大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系,最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录能达到很高的水平。T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7 RNA聚合酶,因此T7 RNA聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。噬菌体DE3是噬菌体的衍生株,一段含有lac,lacUV5启动子和T7 RNA聚合酶基因的DNA片段倍插入其int基因中,用噬菌体DE3的溶源菌,如BL21(DE3)、HMS174(DE3)等作为表达载体的宿主菌,调控方式为化学信号诱导型,类似于Lac表达系统
14、。2 SDS-PAGE检测表达的蛋白质聚丙烯酰胺凝胶,是由丙烯酰胺单体(Acr)和少量的交联剂N,N”-甲叉双丙烯酰胺(Bis),在催化剂(过硫酸铵或核黄素,前者为化学聚合,后者为光聚合)和加速剂TEMED(N,N,N,N,四甲基乙二胺)的作用下聚合交联成的三维网状结构的凝胶。改变单体的浓度或单体与交联剂的比例,可以得到不同孔径的凝胶(孔径大小可以通过改变单体Acr的浓度或单体与交联剂的比例而控制)。蛋白质分子是两性电解质分子,在直流电场内可以移动,PAGE过程中具有三种物理效应: (1)凝胶对样品分子的筛选效应(分子筛效应) 颗粒小、呈球形的样品分子移动快,颗粒大、形状不规则的分子通过凝胶孔
15、洞时的阻力大,移动慢;(2)不连续系统对样品的浓缩效应。凝胶层的不连续:浓缩胶的孔径大,分离胶的孔径小,在电场的作用下,蛋白质颗粒在大孔胶中泳动时的阻力小,移动快,而在小孔径中,移动慢。因而在两层凝胶交界处,由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。缓冲液离子成分及pH的不连续:在两层凝胶中均有三羟甲基氨基甲烷(Tris)及HCI。Tris的作用是维持溶液的电中性及pH值,是缓冲配对离子,HCI在任何pH值溶液中均易解离出氯离子,它在电场中迁移率大,走在最前面,故称为快离子或前导离子。电极缓冲液中的甘氨酸(Gly)在pH8.3的缓冲液中其解离度很小,仅为0.11,因而在电场中迁移
16、率很小,称为慢离子或尾随离子。血清中,大多数蛋白质等电点在5.0左右,在pH8.3或6.7时均带负电荷,在电场中移向正极,其有效迁移率介于快慢离子之间,于是蛋白质就在快慢离子间形成的界面出,被浓缩成极窄的区带。三者的有效迁移率为m氯氯 m蛋白蛋白 m甘甘(m为迁移率,为解离度),当进入pH8.9的分离胶时,甘氨酸解离度增加,其有效迁移率超过蛋白质,因此氯离子及甘氨酸离子沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于分子量大,被留在后面,然后分成多个区带,因此分离胶之间pH的不连续性可控制其迁移率。在浓缩胶中要求慢离子较所有被分离样品的有效迁移率低,以使样品在快慢界面之间被浓缩。进入分离胶后,慢离子的有效
17、迁移率比所有样品的有效迁移率高,使样品不再受离子界面的影响。电位梯度的不连续性:电位梯度的高低与电泳速度的快慢有关。电泳开始后由于快离子迁移率大,就会很快超过蛋白质,在快离子后面形成一个离子浓度低的区域即低电导区。低的电导区就具有较高的电位梯度,而高的电位梯度又使蛋白质和慢离子在快离子后面加速泳动。当三者的迁移率与电位梯度的乘积彼此相等时,三者的泳动速度就相等。在快慢离子的移动速度相等的文台建立后,二者之间形成一个稳定而又不断向阳极移动的界面。而蛋白质的有效迁移率在快慢离子之间,因此也就聚集在这个移动附近,被压缩成一个狭小的中间层。(3)电荷效应当进入pH8.9的分离胶后,各种血清蛋白质所带静
18、电荷不同,而有不同的迁移率。表面电荷越多,则迁移快;反之则慢。因此各种蛋白质按电荷少,分子量大小及分子形状以一定的顺序排列形成一个个区带。不连续聚丙烯酰胺凝胶系统所具备的电荷效应、分子筛效应和浓缩效应大大提高了它的分辨率。3 蛋白的提取与纯化His-Tag融合蛋白是目前最常见的表达方式,而且很成熟,它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性,无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和色谱去(IMAC)纯化。 IMAC(Immobilized Metal-ion affinity chromatography)是Porath et al.1975年用固定IDA作为配基的填料螯合
19、过渡金属铜、镍、钴或锌离子,可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白,1987年 Smithetal. 发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA-sephadex G-25作用力更强,此前在1986年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadex G-25亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。同年1987年Hochuli et al.发现带有相连组氨酸的多肽和Ni2+-NTA填料作用力更强于普通的肽,1988年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽,无论是在天 然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果,此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC变得
20、非常普遍,相对而言,不带标签的蛋白纯化就非常困难,所以 表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC纯化变成最常用而且最有效的研究蛋 白结构和功能的有力手段。1986年Porath et al.还发现Fe3+-IDA-sephadex G-25可以用于磷酸化蛋白的纯化,而后发现Ga3+-IDA也有同样的效果,这样螯合这两种金属离子的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和纯化,同时 IMAC也可以用于纯化各种和金属离子结合的多肽,应用非常广泛。4免疫血清的制备及检验免疫血清的制备是一项常用的免疫学实验技术。高效价、高特异性的免疫血清可作为免疫学诊断的试剂(如用于制备免疫标记抗体等),也可供特异性免疫治疗用。
21、免疫血清的效价高低取决于实验动物的免疫反应性及抗原的免疫原性。如以免疫原性强的抗原刺激高应答性的机体,常可获得高效价的免疫血清。而使用免疫原性弱的抗原免疫时,则需同时加用佐剂以增强抗原的免疫原性。免疫血清的特异性主要取决于免疫用抗原的纯度。因此,如欲获得高特异性的免疫血清,必须予先纯化抗原。此外,抗原的剂量、免疫途径及注射抗原的时间间隔等,也是影响免疫血清效价的重要因素应予重视。具有免疫原性的抗原可刺激机体相应B细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特异性抗体。由于抗原分子表面的不同决定簇为不同特异性的B细胞克隆所识别,因此由某一抗原刺激机体后产生的抗体,实际上为针对该抗原分子表面不同决定簇的抗体混合
22、物(即多克隆抗体)。另外,抗体的产生具有回忆应答的规律性,牨m现为初次免疫注射与再次免疫注射后的抗体应答特点截然不同。这是由于记忆性B细胞参与再次应答所致。5 western blottingWestern免疫印迹,是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为
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