《spinosad作业.doc》由会员分享,可在线阅读,更多相关《spinosad作业.doc(23页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、多杀菌素(spinosad,1)是由刺糖多孢菌合成的大环内酯类抗生素1,分子中含有独特的四环结构,四环母核的9、17位上分别连接有L鼠李糖和D-福乐糖胺。1类化合物中,活性最高的两个组分是spinosyn A和spinosyn D(图1)2,其他组分活性较弱。1具有新颖、独特的作用机制,对鳞翅目、双翅目等害虫表现出极高的毒性3,而对大多数益虫4,水生动物5和哺乳动物6毒性很低。作为新一代生物杀虫剂,开发1具有良好的经济与社会效益。培养条件将SP一29菌株接种于斜面培养基,2 8培养8d,洗下孢子接入种子培养基,于2 8摇床(240rmin)培养72h。种子液按20的接种量接入发酵培养基,于28
2、摇床(240rmin)培养168h。斜面培养基gL:葡萄糖10,脱脂奶粉25,酵母提取物3,MgSO。7H20 2,琼脂2;pH65。发酵培养基gL:葡萄糖40,棉籽粉10,脱脂奶粉20,CaC033;pH70。种子培养基g-L一:葡萄糖10,脱脂奶粉25,酵母提取物3,MgS047H20 2;pH65。优化后的发酵培养基(gL):葡萄糖378,糊精420,棉籽粉223,脱脂奶粉90,CaC0330。按此配方验证,l效价为3427“gm1.前体的调控作用:与其他大环内酯类抗生素相似,1也通过聚酮途径合成,促进其产量提高的前体可能为乙酸、丙酸和丁酸9。本实验分别选用乙醇、正丙醇、正丁醇、乙酸钠和
3、丙酸钠作为前体,浓度均为5mmolL,于发酵开始时加入,以不加前体的培养基为对照,测定效价. 结果见表二。表明,所用的前体物质大多未表现出促进作用,原因可能是前体加入的时间和浓度未达要求。选用效价略高的正丁醇作为前体,进一步研究。前体加入时间:前体一般应在菌体对数生长后期、抗生素形成之前加入。从发酵开始时起,每6h取样,测定菌丝浓度和发酵效价,绘制SP29的生长曲线和效价曲线,见图2。正丁醇于发酵30h时补加。正丁醇的补加浓度为10mmolL。1的生物合成通过聚酮途径进行,内酯环由9个乙酸单位和2个丙酸单位构成12,13。正丁醇在某些酶或酶系的作用下,参与内酯环的合成。SP29菌株培养30h后
4、,开始进入次级代谢阶段,加入的正丁醇大部分能作为前体物质参与1内酯环的生物合成,通过加速内酯环的形成提高发酵单位。以浓度为横坐标,以峰面积的平均值为纵坐标绘制标准溶液曲线,得到一条线性关系良好的直线, 其线性回归方程为:Y=64906+6452x,相关系数为0.99973由放线菌刺糖多孢菌发酵产生的抗生素类杀虫剂,兼具生物农药的安全性和化学台成农药的速效性特点其低毒、低残留、对昆虫无敌安全、自然分解快。多杀菌素为新型大环内酯,由21碳四元环内酯上接2个脱氧糖(三氧甲基鼠李糖和福乐糖胺)而成。刺糖多孢菌发酵产物中由6种成分组成(图1),最有活性的是A和D两种组分,这2种组分的差别在于聚酮c6上取
5、代基是甲基还是氢。多杀菌素的生物合成也是采用聚酮合成途径。福乐糖胺的2个氮甲基和三甲氧基鼠李糖的甲氧基来自S-腺苷甲硫氨酸。多杀菌素的聚酮部分不同于常见的I型聚酮(如红霉素、雷帕霉素、泰乐菌素),其聚酮内含有3个环内分子问cc键【1,2】。聚酮链的生物合成: 聚酮结构的生物合成过程也呈现相似的规律3-8。多杀菌素的聚酮是通过在起始单位丙酸上按AAP。AAAAA-AA(A-乙酰,P-丙酰)的顺序添加10个酰基缩合而成的,这10个延伸单位的顺序缩合及其还原修饰过程分别由装配成10个模件的一系列酶所催化【9-11】(图2)。聚酮链延伸完成后,在模件10中硫酯酶的催化下环化,接着在spnF,spnJ,
6、spnL,spnM基因所编码酶的催化下,在大环内酯核分子内c3一c14、C4一C12及C7一C1l之间形成交联桥【11】。三甲氯基鼠李糖的生物台成与连接: 鼠李糖接到糖苷配基上是糖苷配基转换为多杀菌素必需的第一步,3个甲基是鼠李糖接好后才加上去的,并且连接顺序为2 ,3-和4-0H基。这3个甲基来源于S一腺苷甲硫氨酸,鼠李糖则是由葡萄糖-l-磷酸经NDP-4-酮-6-脱氧-D-葡萄糖合成11,12。福乐糖胺的生物合成: 福乐糖胺由NDP-4-酮-6-脱氧-D-葡萄糖(是上述合成三甲氧基鼠李糖的共同中间物)经一系列酶催化生成NDP-福乐糖胺,再由福乐糖胺转移酶催化将NDP福乐糖胺连接到糖苷配基上
7、合成多杀菌素11(图2)。杀菌素生物合成途径中的有关酶及其基因簇: 将刺探多胞菌中有关编码多杀霉素合成限速步骤的有关基因重组到基因组中,增加限速步骤基因的拷贝数,有可能增加多杀霉素的产量【9】.NDP-4-酮-6-脱氧-D-葡萄糖供应量的大量增加导致鼠李糖和福乐糖胺合成的增加,提高了将糖苷配基转化为多杀菌素A和D的能力。【12】合成多杀菌素的新衍生物:将某个基因的片段克隆重组到刺糖多孢菌的基因组,中断多杀菌素生物合成途径中的某个步骤,可导致某些前体产物或支路产物的积累,这些产物有可能成为害虫防治的新产品,也可作为进一步化学修饰的底物,从而研制出新的大环内酯类杀虫剂。用于此目的克隆片段一般为某基
8、因缺失3末端和5 7末端碱基的中间片段,丽个末端碱基缺失分别至少在100个以上,片段长度至少300bp以上,最好600bD以上【5,14,15】。目的研究多杀菌素发酵提取液的脱色工艺,提高多杀菌素成品质量。方法用uv和HPLC检测方法,以脱色率和多杀菌素损失率为指标,考察717强碱性阴离子交换树脂对多杀菌素发酵提取液的脱色效果。结果多杀菌素发酵提取液中色素的最佳吸收波长为410nm:在间歇操作条件下进行脱色,最佳吸附时间为3h、树脂添加量为4(gV)、摇床转速为150rrain、pH值为lO,此条件下,多杀菌素提取液的脱色率达80以上。对鳞翅目昆虫而言,多杀菌素是目前已发现的杀虫剂中选择性最高
9、的化合物之一【2-4】。微生物在发酵过程中都会产生相当量的色素【5】。多杀菌素存在于菌丝体内,在用有机溶剂提取多杀菌素时,由于色素的存在,使提取液呈深黄色,若不经过脱色处理,不仅影响下一步的纯化工艺过程,还影响产品的色泽。在多杀菌素的提取方面。国外大都采用溶剂萃取法和层析柱分离法【6-7】,国内也有使用大孔吸附树脂粗提多杀菌素的研究【8-10】。结构上看,这些化合物属大环内酯类,分子内包含一个独特的四核环系,并连接着两个不同的六元糖(见图13)。四核环系由一个5,6,5一顺一反一反三环系稠合一个十二元大环内酯组成,一个Q,B不饱和酮和一个独立的双键嵌在四核环系中。四核环部分在两个相反端分别由两
10、个羟基取代,与其相连的两个六元糖其中一个是福乐氨糖,另一个是鼠李糖。在四核环系上有很多个手性中心。在天然多杀菌素分离提取物中,两个最高活性组分spinosyn A和D的混合物被称为spinosad,中文通用名为多杀菌素,它是商业化产品的主要成分。另外,还有一些比例较小的组分,其结构列于图13中61。由质谱和核磁以及单晶X一射线衍射研究证实了有关多杀菌素的立体化学结构。多杀菌素为浅灰白色的固体结晶,带有一种类似于轻微陈腐泥土的气味。在水溶液中,它的pH为774,对金属和金属离子28天内相对稳定,商业化产品的保质期为3年。多杀菌素在空气中不易挥发,蒸汽压约为表11概括了多杀菌素A和D的物理和化学性
11、质【9-11】。半衰期多杀菌素在环境中通过多途径组合的方式进行降解,主要为光降解和微生物降解,最终变成碳、氢、氧、氮等自然成分。在土壤中光降解的半衰期是910天。水中光降解的半衰期不到一天,而在叶子表面光降解的半衰期为1616天。无光条件下土壤中有氧分解的半衰期是917天。多杀菌素在pH 57时相对稳定,并且在pH 9时的半衰期至少有200天,所以水解作用对它的降解影响不大。在已知的害虫防治产品中,多杀菌素的作用机制非常新颖和独特。实验证明它对昆虫存在快速触杀和摄食毒性,通过刺激昆虫的神经系统,导致非功能性的肌收缩、衰竭、并伴随颤抖和麻痹。这种作用结果和烟碱性乙酰胆碱受体被激活的结果是一致的。
12、多杀菌素同时也作用于r-氨基丁酸受体,这可能会进一步加强其杀虫活性。多杀菌素在自然或人为光源中会迅速分解为非活性物质,从而降低多杀菌素的杀虫效果。尽管可结晶性和生物活性并不是直接相关,但有实验表明,当化合物的固体形态为晶体时,其相应悬浮剂的光半衰期要比由固玻璃态体泡沫所制得的悬浮剂的光半衰期长很多。【7】多杀菌素的发酵生产:刺糖多孢菌Saccharopoyspors spinosa属糖多孢菌属,是一种好氧型革兰氏阳性的非抗酸性放线菌。它在大多数培养基(如ISP2、ATCCl72、苹果酸钙等)上都能生长良好,形成气生菌丝体。气生菌丝为粉黄色,营养菌丝为黄色到黄褐色,产浅粉黄色孢子,在某些培养基上
13、则生成白色孢子。气生菌丝分隔成以镰刀状和块状排列的孢予链,具有独特的珠状外观,孢子链中有许多空格。孢子链外观为珠状,有孢子壳,表面为针状。刺糖多孢菌的生长温度为15一37,对溶菌酶敏感,在高渗条件下(11氯化钠)可以生长。多杀菌素类化合物的分离。【10-11】:第一种:经710天发酵后多杀菌素的发酵液加入同等体积的丙酮,过滤去除菌体;将滤液的pH调至13,上HP-20ss吸附树脂,然后用含O95的甲醇:乙氰=1:l(含01乙酸钠)溶液梯度洗脱多杀菌素A和D,利HPLC跟踪检测,分段收集洗脱液,得到含多杀菌素洗脱液,浓缩获得多杀菌素浓缩液。将浓缩液用石油醚稀释,上硅胶层析柱,用石油醚和甲醇梯度洗
14、脱,根据HPLC跟踪检测,分段收集洗脱液,分别得到多杀菌素A和D的洗脱液。第二种:发酵液中加入相同体积的丙酮,用陶瓷过滤器或加压过滤器抽滤;调整滤液的pH值至10;加入14一l2滤液体积的乙酸乙酯萃取,弃去不混合的水相,回收乙酸乙酯,将乙酸乙酯萃取液真空浓缩至12体积;向浓缩后的乙酸乙酯溶液中,加入12体积含水的O1M的酒石酸,萃取,分离两相:通过真空蒸发,从水相中回收其中的乙酸乙酯,用反渗透装置浓缩该水溶液;用Na0H调整溶液pH值至10-11:过滤,分离出沉淀物,用水清洗,真空下干燥,即得到多杀菌素。第三种:将发酵液用助滤剂(1硅藻土)过滤,所得的菌体用水冲洗后,加入约两倍体积的甲醇搅拌充
15、分,再次过滤。将甲醇滤出液用二乙基醚萃取三次,得到的浓缩液进一步进行浓缩。将浓缩液通过高效液相色谱仪(硅胶柱),使多杀菌素的各组分分离出来。多杀菌素的测定【35-39】:高效液相色谱(HPLC)分析法是多杀菌素测定的常用方法,其各个组分都可用HPLC进行定性或定量分析。尤其对于监控多杀菌素的发酵生产过程十分有用。1试样预处理将所取的发酵液样离心,弃去上清液,向沉淀中添加甲醇至初始体积,混合均匀,静置至少15分钟。再次离心,用O45m的滤纸过滤上清液。或者,将所取的发酵液样与乙腈(发酵液样:试剂=l:4)或丙酮混合,萃取。均可得到待测试样。2 高效液相色谱(HPLC)系统参数色谱柱;内径8mm,
16、柱长100mm,以4m硅胶、c。为担体流动相:CH。cNMe0HH20(454510),其中含有005的醋酸胺流速:4mLmin检测器:紫外光度检测器,波妊250ntH保留时间:多杀菌素A3637min,多杀菌素D4445min多杀菌素的发酵培养【10,11】:有多种培养基均可用于培养多杀菌素产生菌刺糖多孢菌。大规模发酵时优选的碳源为葡萄糖和麦芽糖,也可使用核糖、木糖、果糖、半乳糖、甘露糖、甘露醇、可溶性淀粉、马铃薯糊精、油酸甲酯、油类等等。优选的氮源为棉子糖、胨化牛奶和消化大豆粉,也可以使用鱼粉、玉米浸液、酵母膏、水解酪蛋白、牛肉膏等。培养基中的营养无机盐应有能产生下列离子的常规可溶性盐:锌
17、离子、钠离子、镁离子、铵离子、氯离子、碳酸根离子、硫酸根离子、硝酸根离子等。如有发泡问题,通常可加入少量的消泡剂来抑制发泡。但在刺糖多孢菌的培养过程中,常规消泡剂会抑制多杀菌素的合成,通常可在培养基中加入豆油来抑制发泡。刺糖多孢菌的培养温度为2433 4C,而台成多杀菌素的最适温度为2830。大规模发酵时应通过通气量和搅拌速度来将罐内溶解氧维持在60以上,最好为6j以上,罐内压力为0034Mpa。培养基平板培养基(glOOml):水解酪蛋白30,酵母抽提物03,葡萄糖10,琼脂25,pH 65。斜面培养基(glOOml):同平板培养基。种子培养基(glOOml):同平板培养基。发酵培养基(glOOml):葡萄糖80,黄豆饼粉1O,棉子粉10,胨化牛奶10,玉米浆10,碳酸钙05,豆油10,pH 70。培养条件斜面培养条件置于28。C的培养箱中,培养811天,依菌落生长情况而定。分离平板培养条件同斜面母瓶培养条件可用新鲜斜面,甘油管保存的孢子悬液或种子液适量接入母瓶,母瓶装液量为25ml250ml或80ml500m1 A,摇床转速220rmin,培养温度28。C,培养时间3天。发酵瓶培养条件将种子液按10的接种量接入发酵瓶中,发酵瓶装液量为25mi250ml或80ml500ml A,摇床转速220rmin,培养温度28C,培养时间7天。
链接地址:https://www.31doc.com/p-2726682.html