TRIzol法提RNA、DNA和蛋白质.doc
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1、TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol试剂有多组分分离作用,与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比,最大特点是可同时分离一个样品的RNADNA蛋白质TRIzol使样品匀浆化,细胞裂解,溶解细胞内含物,同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后,溶液分为水相和有机相,RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA;用乙醇沉淀中间层可回收DNA;用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。TRIzol试剂可用于小量样品(50-100mg组织、5106细胞)也适用于大量样品(1g组织、107细胞)。对人,动物,植物组织,细菌均适用,可
2、同时处理大量不同样品,整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染,可用于Northern Blot,dot blot,ployA筛选,体外翻译,RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内,建议用无RNase的DNase处理RNA样品,避免出现假阳性。共纯化的DNA可用作标准,比较不同样品RNA的得率,也可用于PCR和酶切。蛋白质可用于Western Blotting。规格:100ml 黄色透明液体储存条件:2-8避光保存12个月注意:请勿直接接触皮肤或吞咽,以免灼伤。如接触皮肤应立即用洗涤剂和大量水冲洗。忌用乙醇擦洗,乙醇会加重
3、灼伤程度。预防RNase污染注意事项:1 经常更换新手套,皮肤上常带有的细菌,霉菌可能成为RNase的来源。2 使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交*污染。3 RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染,但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150烘烤4小时,塑料制品可在0.5M NaOH中浸泡10分钟,然后用水彻底清洗,高压灭菌,即可去除RNase。4 配制溶液应使用无RNase的水(将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中,加入DEPC至终浓度0.01v/v,放置过夜,高压灭菌。注:DEPC有致癌之嫌,需小心操作。)RNA的提取准备试剂:氯仿,异丙醇,
4、75乙醇,无RNase的水或0.5SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)操作步骤:1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10。b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。c细胞悬液 离心收集细胞,每5-10106动物、植物、酵母细胞或1107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加T
5、RIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。2将匀浆样品在室温(15-30)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。3可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-810000g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。6. 2-810000g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主
6、要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60。7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。8. 2-810000g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。9. 用75乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75乙醇。2-8不超过7500g离心5分钟,弃上清。10.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀,大约晾5-10分钟即可.不要真空离心干燥,过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25-200l无RNas
7、e的水或0.5SDS,用枪头吸打几次,55-60放置10分钟使RNA溶解.如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。RNA也可用100的去离子甲酰胺溶解,-70保存。注意事项:1.从少量样品(1-10mg组织或102-104细胞)中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml TRIzol匀浆样品,沉淀RNA前加5-10g RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来,糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成,也不影响PCR反应。2匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8一星期以上或-5至-20一年以上。3分层
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