表观遗传学的结构机理研究2009CB825500-G.doc
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1、项目名称:表观遗传学的结构机理研究首席科学家:许瑞明 中国科学院生物物理研究所起止年限:2009.1至2013.8依托部门:中国科学院一、研究内容本项目的主要研究内容是以X光晶体学方法为主要研究手段,结合其它生物物理和生物化学方法,深入研究以下几项表观遗传学的重要问题:组蛋白修饰酶的反应机理和底物特异性主要几类组蛋白共价修饰有乙酰/去乙酰化、甲基/去甲基化、磷酸/去磷酸化、泛素/去泛素化。其中组蛋白的乙酰/去乙酰化和甲基/去甲基化是近年来表观遗传学的研究热点,这也是本项目的研究焦点。尽管这方面的结构研究已有一定的进展,但还有一些重要的问题并不清楚。例如组蛋白H3的第四个赖氨酸(H3K4)和H4
2、K20的三甲基化酶的结构和反应机理还有待解析;到目前为止H3K36和H3K27的甲基化酶识别其对应的赖氨酸的机理也不清楚。我们将着重研究H3K4、H3K36、H3K27和H4K20的甲基化和去甲基化酶的结构机理研究。同时,我们也将进行对组蛋白乙酰/去乙酰化、泛素/去泛素化和磷酸化酶的复合物的结构和功能的深入研究。修饰后的组蛋白识别目前已知的识别组蛋白乙酰化的有Bromo结构域,识别甲基化后赖氨酸的有Chromo,Tudor,PHD,WD40等结构域。其中有的PHD和WD40结构域也和未修饰的组蛋白结合。可以预测的是同一个修饰过的组蛋白末端残基将有不同蛋白质中的以上或全新的结构域识别。例如甲基化
3、后的H3K4可被PHD和Tudor结构域识别。更重要的一个科学问题是一个组蛋白上的多个或多种修饰是怎样被同时识别的。本项目将发展化学生物学新方法来制备有关的组蛋白样品,利用光晶体学、电镜和生物化学、分子生物学方法来研究组蛋白多种修饰的共识别以及新发现的单识别模式,例如PCL的PHD结构域与甲基化后的H3K27的结合。组蛋白修饰酶的活性调控和蛋白质蛋白质相互作用有些组蛋白酶,例如大部分乙酰化酶和甲基化酶,单独就具有酶活性;而另一些组蛋白酶,例如大部分去乙酰化酶和部分甲基化酶和乙酰化酶,只有与其它蛋白质形成复合体时才有酶活性。还有一种情况就是复合体的形成大大地提高了酶活性。组蛋白修饰酶复合体里亚基
4、之间的相互作用是怎样激活或者提高组蛋白修饰酶的活性的结构机理研究在国际上到目前为止还是空白,这也是本项研究的重点。同时,我们也将紧密追踪表观遗传学发展新动向,对于新发现的重要的组蛋白修饰酶与其它蛋白的相互作用,包括HDAC与含PDZ结构域蛋白质的相互作用,及时地阐明它们的结构机理。基于组蛋白修饰酶的药物设计很多组蛋白修饰酶在疾病发生中有很大的作用。例如H3K4,H3K36和H3K79甲基化酶MLL,NSD1和hDot1L在白血病里,而H3K9和H3K27甲基化酶SUV39和EZH2在多种癌症里都有很大的作用。我们过去的结构生物学研究都涉及了相关的甲基化酶。我们将在本项目里继续深入研究与重大疾病
5、相关的组蛋白修饰酶的结构和功能,利用所得到的结构信息用计算生物学和化学生物学的方法进行药物设计的初期研究。以上几个方向将是本项目今后五年的研究重点。为了给进一步深入研究打下基础,我们也将同时开展蛋白质与核小体复合体的探索性研究。这项研究的意义是尽管核小体的晶体结构解析已完成10年多了,到目前为止唯一只有一个与短肽结合的复合体结构被解析。染色质的高级结构及其调控涉及到多种不同的蛋白质与核小体的相互作用,所以这方面的研究将是今后表观遗传学结构机理研究的重点。我们的先期研究工作将从技术层面上探索单个和多个核小体,尤其是包括修饰后的组蛋白的核小体的高效重组途径。二、预期目标1、总体目标本项目的总体目标
6、是使我国在表观遗传学的结构机理研究水平跻身于国际先列。具体的目标为:(1)通过不懈的努力在表观遗传学机理研究领域做出几项有标志性的工作。我们选择的突破口为组蛋白修饰酶的复合体结构,蛋白质和核小体的复合体结构,以及异染色质(heterochromatin)的三维结构研究。(2)在组蛋白修饰酶的催化机制和底物识别机理,以及修饰后的组蛋白的识别研究做作出广泛的贡献。(3)利用所获取的与人类健康和疾病有重大关系的蛋白质三维结构信息开展药物设计研究。(4)通过本项研究建立起一只多学科相互合作的高水平表观遗传学研究队伍,培养一批勇于探索、求是创新的年青研究人才。2、五年预期目标我们期望完成10个以上在表观
7、遗传学里有重要作用的蛋白质和蛋白质复合体的结构和功能研究。力争部分工作在高影响力的国际杂志(例如Nature, Science,Cell)上发表。建立起系统地表达组蛋白修饰酶以及在表观遗传学里有重要作用的蛋白质的表达、纯化、结晶和功能分析平台。探索重组核小体以及包括修饰后组蛋白的核小体的有效途径,为进一步研究蛋白质-核小体相互作用开创局面。从已知化合物文库中筛选出24个对HDAC活性有抑制作用的小分子化合物;用计算机辅助设计,合成,得到一组结构全新的、针对HDAC小分子抑制剂;并进行结构修饰和优化。为深入开展多学科合作、高复杂性的表观遗传学结构机理研究打下深厚的基础。三、研究方案1、总体研究思
8、路本课题选择在表观遗传调控过程中具有重要生物学意义、与重大疾病的发生和发展相关的蛋白体系为研究对象,特别是对一系列组蛋白修饰酶和与其相互作用的调控蛋白的结构和功能研究。我们将运用现有的各种基因克隆、蛋白质表达和纯化技术获取大量蛋白质和蛋白质复合物的样品;运用X-射线晶体衍射法和溶液NMR方法测定它们的晶体结构或溶液动态结构,通过结构分析揭示组蛋白修饰酶的活性中心组份和结构、底物和产物特异性的决定因素、蛋白质-蛋白质相互作用的位点、作用的方式、以及调控网络关系;我们将用化学生物学的方法合成有活性的修饰后的组蛋白将其作为组蛋白去甲基化和去乙酰化酶的底物,用来制备修饰过的核小体和提供表观遗传细胞生物
9、学研究的新手段;冷冻电镜的手段来研究表观遗传中的大复合体和染色质的高级结构;结合结构生物学、化学生物学和药物化学的方法进行药物设计和筛选。同时,我们也将运用生物化学、分子生物学、细胞生物学、遗传学和生物信息学等方法对于组蛋白修饰酶和相关的复合物进行基于结构信息的功能研究,这包括利用模式生物C.elegans的研究平台探索组蛋白的表观遗传修饰在个体发育,尤其是C.elegans寿命,性腺发育和生殖发育中的调控作用。 2、技术路线本课题主要运用同生物信息学、分子生物学、生物化学、细胞生物学、遗传学、结构生物学和其它生物物理等方法, 针对一些参与组蛋白修饰过程并具有重要生物学意义与重大疾病相关的蛋白
10、和蛋白复合物,开展功能、结构、相互作用关系、分子作用机制、以及临床应用可能性的研究。主要研究方法和技术路线概述如下:(1)可溶性蛋白质和蛋白质复合物样品的制备为获得可用于结构和功能研究的大量可溶性蛋白质,我们将首先在大肠杆菌体系中构建和表达目标蛋白。同时,对一些溶解性差、表达量低的蛋白质,我们将尝试其它的原核和真核表达载体和系统(包括酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞),表达不同标签的融合蛋白以及无细胞体外蛋白表达系统等进行表达条件的摸索。一旦表达成功,我们将尝试不同的蛋白质分离和纯化方法(包括亲和柱层析、离子交换柱层析、疏水柱层析和分子筛柱层析),以期获得具有活性、且适合于结构和功能研究的蛋白质。
11、对功能特别重要的蛋白质或蛋白质结构域,如有必要,我们将根据生物信息学预测的二级结构,对蛋白质表面上一些氨基酸进行突变和修饰,以增加蛋白质的可溶性和稳定性。为获得稳定的、均一组分的蛋白质复合物,我们将尝试不同的原核和真核表达系统和载体(包括共表达)、不同的分离和纯化方法,并通过酵母双杂交、体外Pull-down和共沉淀加以验证,以获得具有活性、且适合于结构和功能研究的稳定蛋白质复合物。另外,我们将运用生物信息学方法构建蛋白-蛋白相互作用的模型,并根据相互作用方式对蛋白质表面上一些氨基酸进行突变和修饰,以增加蛋白-蛋白之间的相互作用能力,有利于蛋白质复合物的形成。此外,运用最新发表的以相图为基础的
12、生物大分子“可结晶性”的新概念提高蛋白质晶体生长的成功率。为保证实验的成功,我们将同时开展对一些具有重要功能的蛋白质结构域的克隆、表达和纯化的工作,由于目前对这些含有多结构域的大真核蛋白质的结构域的划定尚不明确,我们将运用生物信息学的方法来帮助进行蛋白质的结构域预测,并通过系统的片段缺失和点突变筛选,寻找具有合适大小和功能的蛋白质结构域进行研究。(2)稳定蛋白质及蛋白质复合物的晶体生长和结构解析一旦获得可供结构研究的蛋白质和稳定蛋白质复合物样品,我们将运用动态光散射仪对蛋白样品的溶液状态进行分析,考察其是否处于均一状态,在不同条件(温度、浓度、pH等)下的稳定形态和凝聚状态,同时运用溶液光谱(
13、包括CD光谱和荧光光谱)方法分析蛋白质在溶液中的构象变化。综合各种因素,初步确定适合于结晶实验的条件。然后,进一步摸索晶体生长的条件,尝试大量不同的沉淀剂、蛋白质浓度、pH和缓冲体系、以及不同添加剂等,得到高衍射质量的晶体用于X-射线衍射分析。一旦获得蛋白晶体,将利用X-射线衍射仪进行初步衍射实验,以帮助进行结晶条件的优化和低温冷冻条件的筛选。具有高衍射能力的蛋白晶体将运用国内外同步辐射光源进行高分辨率的X-射线衍射数据的收集。并运用单波长反常散射法、多波长反常散射法、同晶置换法、和分子置换法解析各种蛋白和蛋白复合物的三维晶体结构。(3) 蛋白动态复合物相互作用介面的结构与动力学研究溶液NMR
14、技术是研究蛋白质-蛋白质相互作用、测定蛋白质-蛋白质复合物三维结构的很有用的工具。根据蛋白质-蛋白质相互作用的强度,可选择相应的NMR技术来研究蛋白质-蛋白质的相互作用,如化学位移扰动法、分子间转移NOE(TRNOE)、酰胺质子交换率扰动法、横向或纵向弛豫速率扰动法、线宽变化、分子间饱和转移、分子间NOE等,以及各种各样的滤波或半滤波技术( filter or half-filter)。细胞内许多蛋白质之间存在着很弱的相互作用(解离常数Kd 10-6 M),只能形成低亲和力的、瞬时复合物,但这些瞬时复合物在细胞活动的分子调控中发挥着相当重要的作用。我们将选择分子量合适的蛋白质-蛋白质复合物,运
15、用异核多维NMR技术,在接近生理条件的溶液状态下,研究这些蛋白质-蛋白质复合物,特别是低亲和力的、瞬时蛋白质复合物的动态结构和性质、蛋白质-蛋白质相互作用的分子机制,探测蛋白质-蛋白质是否发生相互作用及其亲和力(Kd)、蛋白质-蛋白质的结合界面等。通过测定分子间的NOE确定蛋白质分子之间的距离约束,在稀释的定向介质中,如磷脂双层混合胶粒(Bicelle bicelle), 聚丙烯酰胺凝胶(Polyacrylamide gel), 纤维状病毒(Filamentous viruses)等, 测定残留的偶极耦合常数(residual dipolar couplings)以确定蛋白质分子之间的相对取向
16、,从而获得蛋白质-蛋白质复合物的空间结构。蛋白质-蛋白质的相互作用往往会引起蛋白质动力学的改变。NMR技术被广泛地用来揭示蛋白质分子和蛋白质-蛋白质复合物的动力学特征。我们将利用异核多维NMR弛豫测量实验,研究皮秒-纳秒时间尺度的蛋白质分子结构的柔性与运动性,以及微秒-毫秒时间尺度的构象交换。通过改变实验条件(如实验温度、蛋白质浓度、pH值、配基类型等),研究蛋白质-蛋白质相互作用过程的热力学、动力学和分子作用机理。(4)大复合体的冷冻电镜研究冷冻电镜方法结合三维重构是近年来发展迅速并正在取得重要突破的技术。和其它方法相比,它具有以下几个方面的优势:1.保持生物样品的活性和功能状态;2.无须制
17、备晶体,特别适合难于结晶的大分子及其复合物的三维结构判定;3.可以做到制样,数据收集,三维重构全过程自动化,为高通量的大分子及其复合物的快速三维结构解析打下基础。同时,随着设备的改进和技术的提高,电镜三维重构的分辨率也迅速提高。现在最高精度已经达到约4A左右。我们将用冷冻电镜方法来研究蛋白质复合体里各亚基之间的空间关系、蛋白质复合体与核小体的相互作用、染色质的高级结构和不同活性状态下的染色质三维结构形态的变化及染色质变化动力学。(5)组蛋白修饰酶活性测定和蛋白质复合物的功能分析我们将利用成熟的甲基化去甲基化酶、乙酰去乙酰化酶、泛素化连接酶/去泛素化酶、激酶等酶活性测定方法来鉴定和比较野生型和突
18、变型的酶活性差别、以及单体和复合体中的酶活性差异。以下方法将用来测定蛋白质-蛋白质相互作用和寻找与已知功能蛋白质相互作用的蛋白和蛋白复合物: 表面等离子共振(SPR);酵母双杂交(two-hybrid)系统、体外Pull-down和免疫共沉淀(Co-IP)、二维电泳、TAP和质谱等功能蛋白质组学的方法。我们将通过对蛋白和蛋白复合物的晶体结构的分析,找出在蛋白的生物功能和蛋白-蛋白相互作用中发挥重要作用的氨基酸,运用生物化学、分子生物学、细胞生物学、遗传学和其它生物学和生物物理学方法加以验证;阐述蛋白生物功能的分子基础和作用机理;在细胞水平上验证我们的假设和理论,并且构建相应的基因缺失或基因转染
19、的模式生物,筛选不同表型,建立重要蛋白的功能与疾病的发生和发展的关系。(6) 体内合成有活性的含共价修饰的组蛋白的化学生物学方法具体的做法是修改大肠杆菌或其它细胞内的遗传密码,使得无义的“UAG”密码对应于感兴趣的非天然氨基酸。筛选对非天然氨基酸具有特异性的氨酰-tRNA合成酶的技术路线如下:首先在目标细胞中引入一个外源的氨酰-tRNA合成酶 和tRNACUA, 在目标细胞中外源的氨酰-tRNA合成酶和tRNACUA保持活性,但不与内源的氨酰-tRNA合成酶和tRNA反应,这个条件称为生物正交性。之后还要改变氨酰-tRNA合成酶的专一性,使其只催化tRNACUA与非天然氨基酸发生氨酰化反应。采
20、取的方法:一是将 氨酰-tRNA合成酶 活性部位5-6个氨基酸残基进行PCR随机突变建立氨酰-tRNA合成酶突变库。然后对氨酰-tRNA合成酶突变库使用正负双向选择法:正选择得到对天然氨基酸或非天然氨基酸有活性的氨酰-tRNA合成酶,主要是通过构建一个含有UAG密码子的氯霉素乙酰转移酶,如果无氨酰-tRNA合成酶活性,则细胞无法表达全长的氯霉素乙酰转移酶而无法存活。负选择剔除掉对天然氨基酸有活性的氨酰-tRNA合成酶,识别内源的天然氨基酸的质粒编码一种细胞内毒素而死亡。 最终得到只对非天然氨基酸有专一性的氨酰-tRNA合成酶。凝胶电泳和质谱实验验证最终将非天然氨基酸通过特殊密码子UAG添加到蛋
21、白质链中。 (7)基于表观遗传调控的药物开发前期工作我们将用四种途径初步筛选出一系列的候选小分子:1)基于蛋白质结构的计算机虚拟筛选;2)基于化学小分子文库的高通量药物筛选;3)基于靶蛋白结构,合理设计针对性强的、结构新颖的小分子抑制剂;4)对于已知的小分子抑制剂做结构和性能改良。以下是以去乙酰化酶HDAC8为例的几种筛选途径的典型步骤:a)基于靶蛋白HDAC8的结构模型,通过对已知活性部位和结构表面的分析,得到几个潜在的小分子结合位点;b)选定一个规模合适的小分子结构库,将库中的每个小分子和几个潜在的结合位点进行快速的对接,初步筛选出一系列的候选小分子;c)对这一系列的候选小分子,进行较精细
22、的分子对接,将候选小分子规模缩小到实验容许的水平;d)然后检验候选小分子是否有生物学活性(具体见课题六研究内容);基于化学小分子文库的药物筛选我们将使用具有一定规模的化合物文库进行高通量的HDAC抑制剂筛选。中山大学正在建设一个约有6万个小分子化合物的文库可供使用。中科院药物研究所也具有一个规模可观的小分子化合物的文库。中科院广州生物医药与健康研究院的丁克教授愿意提供一个小规模的小分子化合物的文库(约6000个化合物)。对候选小分子化合物的生物学活性再进行系统检测 (具体见课题六研究内容);基于靶蛋白结构,合理设计、合成针对HDAC8的结构新颖的小分子抑制剂a)对筛选得到的先导化合物,通过分子
23、叠合等方法构建出小分子的三维药效团;b)通过计算模拟的方法揭示小分子结合部位和三维药效团之间相互作用的分子机制;c)根据靶蛋白结合部位和三维药效团之间的作用模型设计出更合理有效的小分子抑制剂。d)根据上述设计,利用组合化学方法合成化合物;e) 对所合成的小分子化合物的生物学活性再进行系统检测(具体见课题六研究内容);通过对SAHA等HDAC潜在广谱类抑制剂进行结构改造,得到起专一性抑制作用的小分子a)建立SAHA或其他的HDAC广谱类抑制剂和HDAC8的相互作用的可能的分子模型;b)从分子模型出发,修改广谱类抑制剂的药效基团,通过自由能计算等方式提高小分子的结合专一性;c)对设计的结果通过对组
24、蛋白乙酰化测定观察这些化合物对HDAC的抑制效应,迭代这一过程,逐步保留对HDAC8特异性升高,对其他组蛋白去乙酰化酶特异性减弱的操作。3、 项目创新点本项目的主要创新点在于瞄准表观遗传学的分子机理这个重大前沿科学问题进行系统性、系列性、多层次、多方面的研究。本项研究对象包括了所有常见的组蛋白修饰酶;研究对象的复杂性包括了从单个蛋白质或其中的结构域到多蛋白复合体以及蛋白质复合体与核小体的结合;研究的手段包括X光晶体学、核磁共振、冷冻电镜等主流结构生物学研究手段,以及生物化学、化学生物学、细胞生物学、遗传学、药学等方法。研究目标从搞清楚组蛋白的赖氨酸上加一个还是三个甲基到组蛋白修饰对于损伤应答和
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