4-2014-工作手册-第四章-第四节-兽药及违禁药物.doc
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1、第四节兽药及违禁药物1动物源性食品中-受体激动剂残留GC/MS法测定的标准操作程序1 适用范围本程序适用于动物源性食品中10种-受体激动剂残留的气相色谱质谱联用法测定。当试样取5.0g时,本方法10种-受体激动剂的检出限为0.5g/kg1.0g/kg,定量限为1.0g/kg 2.0g/kg。2 原理本方法采用-葡萄糖苷酸酶芳基硫酸酯酶解动物组织,然后通过固相萃取柱净化,用双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)+1%()三甲基氯硅烷(TMCS)衍生后采用GC/MS测定动物组织中10种-受体激动剂残留,同位素内标法定量。3 试剂除非另有说明,所有试剂均为分析纯。3.1 甲醇(色谱纯);3.2 盐酸;
2、3.3 正己烷;3.4 乙酸乙酯(色谱纯);3.5 氨水;3.6 无水硫酸钠,于450灼烧4h,冷却后贮于干燥器中备用。3.7 特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇、马布特罗、西马特罗、班布特罗、克仑潘特、苯氧丙酚胺、卡布特罗;莱克多巴胺标准品。3.8 D9-克伦特罗、D3-沙丁胺醇、D5-莱克多巴胺内标。3.9 -葡萄糖苷酸酶芳基硫酸酯酶购自Sigma;3.10 双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)+1%()三甲基氯硅烷(TMCS)。3.11 -受体激动剂标准储备溶液:分别称取各种受体激动剂标准品10mg于10mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,存放在-18冰箱中备用;受体激动剂混合标准使用液用甲
3、醇稀释至0.1mg/L。3.12D9-克伦特罗、D3-沙丁胺醇、D5-莱克多巴胺(1.0mg/L)受体激动剂内标混合液:使用时用甲醇稀释储备液至1.0 mg/L混合液。4 仪器与耗材4.1 气相色谱质谱仪。4.2 漩涡混匀器。4.3 氮吹仪。4.4 具塞刻度试管:10 mL。4.5 固相萃取仪。4.6 离心机:最低转速8,000r/min4.7 SLW 固相萃取柱:规格为500mg/6ml(杭州福裕科技服务有限公司)。5 操作步骤5.1 样品采集、制备、保存动物组织(包括肌肉、肝脏、肾脏、肺等)采集200_500g,取肌肉部分用组织捣碎机(或者榨汁机)绞碎,四分法取50100g,放在具塞玻璃瓶
4、或者食品袋中,贴上标签后,放在-18冰箱冻藏。5.2 样品酶解称取5.0g经绞碎均匀的动物组织于50mL离心管中,分别加50L 1.0 mg/L受体激动剂内标混合液,静置10min,加入15ml0.2mol/LpH5.2乙酸钠-醋酸缓冲液,用匀质机匀质20s,加入50L-葡萄糖醛苷酶芳基硫酸酯酶液,在37水浴中水解16h后取出冷却,8,000 r/min离心10min,分出上层溶液,(注意如果液面有脂肪析出,可以用棉花过滤)用2.0mol/盐酸溶液调节至2.00.1(pH测定仪),再在8,000 r/min离心10min,分出上清液待用。5.3 样品净化 取SLW(或者SLS)固相萃取柱,先用
5、甲醇5mL、水5mL、50mmol/L盐酸5mL活化柱子,然后将10mL上清液加到柱子上过柱,再用5mL水淋洗除杂,真空泵抽干5min,先用5mL甲醇洗脱,然后用10ml5%氨化乙酸乙酯洗脱收集,在50水浴中氮气吹干。5.4 样品衍生 蒸发剩余物加0.1mL双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA) +1%()三甲基氯硅烷(TMCS),在80的烘箱中加热衍生1.0h,氮气吹干,加0.2mL甲苯溶解;另外分别取标准溶液,加50L内标使用液,氮气吹干后与样品同时进行衍生化。取1.0L甲苯溶液进行GC-MS分析。5.5 样品分析5.5.1 色谱质谱参考条件a) HP5 MS 5%苯基甲基聚硅氧烷弹性石英毛
6、细管柱(30 m0.25 mm0.25m)或等同柱;b) 进样口温度: 280;c) 柱温:初温100,保持3min,然后以10min升至280,保持5min,300postrun 5min;d) 载气:氦气,纯度99.999,流速1mL/min;e) 进样量: 1-2L;f) 电离方式:EI源, 70eV。 g) 离子源温度:230;h) 进样方式:不分流进样;i) 溶剂延迟:11min。5.5.2 选择离子监测方式:监测离子见下表1,标准总离子流图见下图1, 样品空白离子流图见图2。表1参考保留时间及监测离子化合物内标保留时间定量离子m/z定性离子m/z检测限g/kg定量限g/kg马布特罗
7、D9克伦特罗11.3986277、296、3671.02.0特布他林D3-沙丁胺醇13.7735686、426、3700.51.0D9克伦特罗13.7826295卡布特罗D9克伦特罗13.7832586、282、3081.02.0克伦特罗D9克伦特罗13.8326286、243、2771.02.0西马特罗D9克伦特罗14.0072219、276、2871.02.0D3-沙丁胺醇14.5137286、443沙丁胺醇D3-沙丁胺醇14.5236986、440、3840.51.0克仑潘特D9克伦特罗14.82100262、243、2771.02.0苯氧丙酚胺D5-莱克多巴胺17.93178267、4
8、30、2671.02.0班布特罗D5-莱克多巴胺18.9835486、282、354、1.02.0D5-莱克多巴胺20.26255507莱克多巴胺D5-莱克多巴胺20.26250179、267、5021.02.01113 1517194861 12 16e1 2103+4 56+7+89 11 12+13强度10412+13t/min81.马布特罗;2.特布他林;3+4 D9-克伦特罗+卡布特罗;5. 克伦特罗;6+7+8. 西马特罗+D3-沙丁胺醇+沙丁胺醇;9. 克仑潘特;10.苯氧丙酚胺;11.班布特罗;12+13 D5-莱克多巴胺+莱克多巴胺图1受体激动剂标准及内标总离子流图11151
9、71921 4 81216 37 12强度104133.D9-克伦特罗;7.D3-沙丁胺醇;12 D5-莱克多巴胺图2样品空白空白离子流图5.5.3 样品测定分别取100,150,200,250,500L混合标准使用液,加50L内标使用液,氮气吹干衍生后进行仪器分析,绘制标准曲线;然后进行样品测定,根据标准曲线计算样品中10种受体激动剂含量n。根据受体激动剂保留时间及碎片离子进行定性、定量分析。6 计算试样中对应10种受体激动剂含量按式(1)计算,结果保留小数点后1位:(1)式中:X 试样中对应10种受体激动剂含量,单位为微克每千克(g/kg);n 试样中中色谱峰与内标色谱峰的峰面积比值对应的
10、受体激动剂的含量,单位为纳克(ng);m 样品的取样量,单位为克(g);7 精密度本方法相对标准偏差为7.6%15.4%。8 说明8.1 5%氨化乙酸乙酯要求现配现用,充分混匀。8.2 为了保证分析结果的准确,要求在分析每批样品时,进行样品加标5.0g/kg试验,计算添加回收率,多组分残留测定添加回收率应在60-120%范围之内。对于每批固相萃取柱应该用标准溶液进行回收实验,标准回收率在80%以上。2肉及肉制品中-兴奋剂的测定酶联免疫方法1 适用范围本方法适用于肉及肉制品中-兴奋剂这是瘦肉精那个吗?的测定。2 原理试剂盒提供的微孔板上的微孔预包被了-兴奋剂抗体。标准品溶液中的-兴奋剂即抗原和样
11、品中的抗原分别与酶标记结合物(酶标记抗原)同时竞争包被抗体上的有限结合位点,形成抗体/抗原、抗体/酶标记抗原复合物。室温孵育,使竞争反应完全。洗涤酶标板,除去游离的反应物。加入底物,在室温下,酶标记结合物上的辣根过氧化物酶催化底物发生显色反应,孵育一定时间使颜色发生最大变化。加入终止液使反应终止,同时反应物颜色由蓝转黄。颜色的深度与标准品/样品中的-兴奋剂含量成反比,使用酶标仪在450 n m波长下读取相应的吸光度值。构建标准曲线,计算样品中-兴奋剂浓度。3 试剂3.1 -兴奋剂检测试剂盒3.1.1 微孔板3.1.2 稀释/洗涤缓冲液(浓缩):用970mL双蒸水稀释一整瓶洗涤缓冲液后方可使用。
12、稀释后,+2- +8可保存30天。3.1.3酶标记结合物稀释液3.1.4 酶标记结合物(浓缩):试剂盒以浓缩液形式提供酶标记结合物,必须用试剂盒提供的酶标记结合物稀释液稀释至工作液浓度后方可使用。需要多少制备多少,现用现配。具体稀释方法请参照试剂盒提供的说明书”CONJUGATE DILUTION”. 建议按1:200稀释,如将20ul酶标记结合物浓缩物加至4ml酶标记结合物稀释液中(满足32孔检测)。稀释后的酶标记结合物应立即使用,剩余的酶标记结合物(浓缩)应在+2- +8避光下保存。3.1.5 底物3.1.6标准品3.1.7终止液3.1.8 高标100ng/ml3.2 乙酸乙酯;3.3 盐
13、酸(1M);1.4 氢氧化钠(1M)4仪器与耗材4.1 装载450nm滤光片的酶标仪,推荐同时装载630nm参考滤光片;4.2 37孵育器;4.3 移液器及吸头:10 uL -125 uL;4.4 密封膜或微孔板密封盖4.5 离心机5 操作步骤5.1 样品制备5.1.1 称取10.1g均质后的组织样品于带盖的离心管中5.1.2 加入5mL乙酸乙酯,然后以5000rmin以上的速度涡旋30s,注意防止乙酸乙酯飞溅。5.1.3 7000rmin的速度离心2min,注意盖上盖子防止乙酸乙酯挥发,吸取上层有机溶剂于离心管中。5.1.4在有机溶剂中加入2mL010molL的盐酸溶液,旋涡30s。5.1.
14、5 5000rmin的速度离心2min,吸取2ml下层溶液。5.1.6 用25molL氢氧化钠溶液调节pH至为7。5.1.7 调整后的液体即可上板检测。5.2 测定5.2.1 将足够标准品、样品所用数量的孔条插入微孔架,标准品和样品做两个平行实验,记录标准品和样品的位置。5.2.2加入25ul的标准品或处理好的样品到各自的微孔中,标准品和样品做两个平行实验,然后加入100ul酶标记结合物到每个微孔。5.5.3用密封膜或微孔板密封盖将微孔板密封,在桌面做圆周运动将内容物混匀,然后将其置于室温下(1925)黑暗孵育1小时。5.2.4 翻转轻拍微孔板,将微孔内液体倒出。在15分钟内用稀释的洗涤/缓冲
15、液洗涤酶标板6次(洗涤中要确保所有的孔均注满洗涤缓冲液),最后一次洗涤完成后,将酶标板翻转置于吸水纸巾上并轻拍以去除残液,直至彻底干燥。5.2.5 干燥后,立即用8通道移液器向每一个微孔移取125L底物溶液。完成后,从一端至另一端轻拍微孔板, 19至25黑暗孵育202分钟。5.2.6 每个孔加入100L 终止液终止反应,反应物的颜色会由蓝色转为黄色。5.2.7于10分钟内,用450nm的酶标仪测定吸光度值。如果有必要,可以采用 630nm参考波长。6.计算分别计算标准品和样品的平均吸光值。以吸光度值为纵坐标,以标准品浓度的对数值(log10)为横坐标构建标准曲线。从标准曲线上读取样品的浓度,由
16、于样品制备过程中被不同程度的稀释,因此从标准曲线得出的浓度需乘以稀释系数2才为样品实际浓度。也可使用数据处理软件。7. 说明7.1 本产品仅用于体外诊断,不要用口移取溶液。7.2 请在正规的实验室中,由受过相关培训的实验人员进行操作,并遵守实验室操作守则。7.3 洗涤缓冲液中含有防腐剂,请勿食用或与皮肤、粘膜接触。7.4 温度低于20或试剂及标准品没有回到室温(15-25)会导致所有标准的值偏低。 7.5洗板过程中如果出现板孔干燥的情况,则会出现标准曲线不成线性,重复性不好的现象,所以洗板排干后应立即进行下一步操作。 7.6 标准物质和显色液对光敏感,最好避免直接暴露在光线下。 7.7 混合要
17、均匀,洗板要彻底(包括加样品和标准液的时候都必需充分混合均匀)。 7.8 反应停止液为强酸性物质,避免接触皮肤。 7.9 不要使用过了有效期的试剂盒,也不要稀释或搀杂使用不同生产厂家的试剂盒这样会引起灵敏度降低。3 食品中氯霉素残留测定法测定的标准操作程序1 适用范围本程序适用于规定了肉制品、水产品、蜂蜜和乳制品等食品中氯霉素的气相色谱质谱联用负化学源法(GC-MS-NCI)定性、定量检测。本方法检出限和定量限分别为0.1g/kg和0.3g/kg。2 原理样品经乙酸乙酯提取,液液分配、固相萃取净化,硅烷化衍生后采用GC-MS-NCI选择离子方式检测,内标法定量。3 试剂3.1 乙酸乙酯:色谱纯
18、。3.2 甲苯:色谱纯。3.3 正己烷:色谱纯。3.4 氯霉素标准储备液1mg/mL(甲醇):准确称取氯霉素标准10.0mg,用甲醇溶解并定容至10mL, 存放在冰箱中备用。3.5 D5-氯霉素同位素内标储备液0.1mg/mL:取D5-氯霉素标准1.0mg,用甲醇溶解并定容至10mL, 存放在-18冰箱中备用。3.6 氯霉素标准使用液50ng/mL:由1mg/mL的储备液临用前分级用甲醇稀释得到50ng/mL, 于4冰箱中保存,有效期7天。3.7 D5-氯霉素同位素内标使用液50ng/mL:由0.1mg/mL的储备液分级用甲醇稀释得到50ng/mL.,于4冰箱中保存。3.8 衍生试剂:BSTF
19、A+1%TMCS。4 仪器和耗材4.1 气质联用仪GC-MS-NCI4.2 均质机4.3 氮气吹干仪4.4 离心机4.5 硅胶固相萃取柱:规格500mg/6mL。5 操作步骤5.1 试样的制备与保存5.1.1 肉制品和水产品 肉制品和水产品去骨后用搅肉机搅碎并混合均匀,按法取样后测定,留样密封,做好标记后于18冷冻保存。5.1.2 蜂蜜和乳制品 对无结晶的实验室样品,将其搅拌均匀。对有结晶的样品,在密闭情况下,置于不超过60的水浴中温热,振荡,待样品全部融化后搅匀,迅速冷却至室温。按法取样后测定,留样密封,并做上标记于18冷冻保存。5.2 样品提取5.2.1 肉制品和水产品称取4g绞碎的样品,
20、加100uL内标使用液,20mL乙酸乙酯,均质,离心,取上清液10mL,50氮气吹干溶剂后,加入0.5mL甲醇溶解残渣,再加4mL的1mol/L NaCl溶液,混匀后加2mL2的正己烷脱脂,最后用3mL、2mL乙酸乙酯分别萃取水相,离心后取乙酸乙酯层,合并用氮气吹干。5.2.2 蜂蜜和乳制品 称取4g混匀的样品,加100uL内标使用液、5mL水、20mL乙酸乙酯,混匀后室温超声提取5min,离心,取上清液10mL,50氮气吹干溶剂后,加入0.5mL甲醇溶解残渣,再加4mL的1mol/L NaCl溶液,混匀后加2mL2的正己烷脱脂,最后用3mL、2mL乙酸乙酯分别萃取水相,离心后取乙酸乙酯层,合
21、并用氮气吹干。5.3 样品净化 由于负化学源对氯霉素的选择性较高,基体干扰较少,样品经上述液液分配净化后可以直接硅烷化后进行筛选。对于有干扰或者阳性的样品,可以按下述方法固相萃取净化。5.3.1 硅胶柱的活化,依次用5mL的乙腈和二氯甲烷淋洗活化。5.3.2 上述处理后的残渣用1mL二氯甲烷溶解,并定量上样于活化后的硅胶柱中。5.3.3 用10mL二氯甲烷淋洗,并弃去。用10mL乙酸乙酯洗脱,并收集洗脱液,氮气吹干待衍生化后测定。5.4 衍生化取上述吹干后的残渣加入200uL甲苯,80uL衍生化试剂,混匀,密封,于65烘箱中反应20min后用氮气吹干,加甲苯0.2mL溶解后测定。取110ng氯
22、霉素标准品,加100uL内标使用液,氮气吹干后同步衍生化测定。5.5 样品分析(色谱质谱测定)5.5.1 色谱条件a) 色谱柱HP-5MS(30m0.25mm0.25um)。柱温100保持1min,以15/min升温到240保持5min;再以10/min升温到270保持5min。b) 进样口和检测器温度分别为250和280。c) 传输管温度280。d) 氦气流速1mL/min。5.5.2 质谱条件负化学源法,四级杆和离子源温度均为150。40甲烷为反应气。氯霉素定量离子466,定性离子468、376、378,D5-氯霉素定量离子471,定性离子473、381;标准品提取离子色谱图见图1。氯霉素
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