发酵工程资料.doc
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1、1、微生物工程:也称发酵工程,它是指利用微生物生长繁殖与代谢活动,通过现代工程技术手段进行工业规模来生产人们所需产品的理论和工程技术体系。是生物工程和生物技术学科的重要组成部分。2、 工业发酵步骤和工艺流程(1) 用作培养菌种及扩大生产的发酵罐的各种培养基的配制(2) 培养基、发酵罐以及辅助设备的消毒灭菌(3) 将培养好的有活性的适量纯种以一定比例转接到发酵罐中(4) 控制最适的发酵条件使微生物生长并形成大量代谢产物(5) 将产物抽提并进精制,以得到合格的产品(6) 回收或处理发酵过程中产生的废物和废水新种分离与筛选的步骤:确定方案样品采集样品的预处理目的菌富集培养菌种分离菌种初筛菌种复筛菌种
2、发酵性能鉴定菌种保藏(1)确定方案:首先要查阅资料,了解所需菌种的生长培养特性。(2)样品采集:有针对性地采集样品。两个原则:样品的来源广泛,获得新的菌种的可能性越大;要了解目标产物的性质和可能产生目标产物的微生物及其生理性,这样就能提高效率,事半功倍。 (3)样品预处理:对样品进行预处理可提高菌种分离的效率。方法有:物理方法:包括热处理、膜过滤法和离心法化学方法:通过在培养基中添加某些化学成分来增加特定微生物的数量。诱饵法:将一些固定物质,如石蜡、花粉、蛇皮、毛发等加到待分离的土壤或水中做成诱饵富集目的菌。(4)目的菌富集培养:主要利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同,使目的
3、微生物在最是条件下迅速地生长繁殖,数量增加,成为优势种。控制培养基的营养成分,如唯一碳源或氮源;控制培养条件:(5)菌种分离:利用微生物菌种分离技术得到纯种。平板划线分离法 稀释分离法 简单平板分离法涂布分离法 毛细管分离法 小滴分离法(6)初筛:从分离得到的大量微生物中将具有目的产物合成能力的微生物筛选出来的过程。平板筛选:用水解圈、变色圈、抑菌圈、透明圈等方法药瓶发酵筛选:菌株摇床培养后,过滤发酵液进行活力测定。(7)复筛:进一步鉴定菌株生产能力,采用摇瓶培养,一般一个菌株重复3-5瓶,培养后的发酵液采用精确的分析方法测定。(8)发酵性能鉴定:将复筛得到的菌株进行生产性能测定。这些特性包括
4、形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。(9)菌种保藏(二)增殖培养增殖培养(也称富集培养、施加选择性压力分离法):就是利用不同种类的微生物在生长繁殖时对环境和营养条件要求不同(温度、湿度、pH、渗透压、氧、碳源、氮源等),人为控制这些条件,使之有利于某一类或一种微生物生长而不利于其他微生物生长,使所需微生物在增殖后在数量上占优势而便于分离,其他微生物几乎不增殖或增殖缓慢,从而达到快速分离纯化的方法。增殖培养即选择培养基和控制培养条件。(三)培养分离纯种分离的方法:划线分离法、稀释分离法。快速分离方法(3种):
5、目的微生物不纯,需分离纯化。采用简便迅速,有一定准确性的检出方法,以提高筛选效率。常用平皿反应法:纸片培养显色法:浸有指示剂滤纸。1. 变色圈:直接用显色剂或指示剂。在菌体筛选中直接用显色剂或指示剂掺入培养基中或喷洒已生长的菌落的培养基表面,由于培养基中所筛选出的微生物产生酸或碱性物质从而使培养基的pH值降低或升高,由于显色剂在不同pH值条件下显色不同,从而形成围绕菌落周围的变了颜色的圈叫变色圈。2. 透明圈:混浊底物被分解后形成透明圈。如可溶性淀粉、碳酸钙等。在固体培养基中加入酶作用的底物或其他物质(都能使培养基产生浑浊)培养微生物,能够利用此底物的酶的产生菌得以生长或微生物能利用此种物质,
6、则在其菌落周围形成一个透明的圈,叫透明圈,也叫水解圈。 3. 生长圈 :利用某些具有特殊营养要求的微生物为工具菌(如营养缺陷型菌株)若分离的微生物能在一般的培养条件下(缺乏上述营养要求的物质)生长而合成该物质,则能使工具菌生长,则在分离的微生物的菌落周围形成工具菌的生长圈,这种圈叫生长圈。 4.抑菌圈:有害菌与能够产生抑菌物质的微生物菌种一起在固体培养基上进行培养时,则在产生抑菌物质的微生物菌落周围产生一个透明的圈(即有害微生物不能生长的形成的圈)叫抑菌圈。 培养基:是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢 产物所需要的,按一定比例配制的多种营养物质的混合物。发酵生产中培养基的类型:(1)孢子培
7、养基(斜面培养基):是供微生物细胞生长繁殖或保藏菌种。包括细菌、酵母等的斜面培养基,霉菌、放线菌的产孢培养基等。特点是富含有机氮源。但放线菌或霉菌的产孢培养基的氮源和碳源不宜太丰富,否则容易长菌丝而较少产孢子。此外,还宜加少量无机盐类。(2)种子培养基: 有较完全和丰富的营养物质,特别需要充足的氮源和必需的生长因子。由于培养时间短,各物质浓度不需太高。为缩短发酵阶段的适应期,还应该考虑与发酵培养基的主要成分相近。(3)发酵培养基: 必须要根据菌体自身生长规律、产物合成的特点来设计。二、发酵培养基的优化1、根据以前的经验以及在培养基成分确定时必须考虑的一些问题初步确定可能的培养基成分首先要做好调
8、查研究工作,了解菌种的来源、生活习惯、生理生化特性和一般的营养要求。即要参照微生物细胞内元素的比例确定培养基的成分和比例。其次,对生产菌种的培养条件,生物合成的代谢途径,代谢产物的化学性质、分子结构、一般提炼方法和产品性质要求等也要有所了解,以便在选择培养基时心中有数。根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑的因素,初步确定可能的培养基成分。 2、通过单因子优化实验确定较适宜的培养基成分及浓度;注意培养过程中pH的变化,观察适于菌种生长繁殖和适于代谢产物形成的两种不同pH,不断调整配比来适应上述各种情况和要求,注意每次只限一个变动条件。3、金属及非金属离子的确定:也是通过单因子试验。4、最
9、后通过多因子实验,进一步优化培养基各成分最适浓度。前体:指一些添加到培养基中的物质,它们并不促进微生物的生长,但能直接通过微生物的生物合成过程结合到产物分子上去,自身结构基本不变,而产物产量却因此有较大提高。(三)酶合成的调节是指酶在数量上和种类上的调节。有两种方式:酶合成的诱导和酶合成的阻遏酶合成的诱导:凡能促进酶生物合成的现象,称为诱导。有组成酶和诱导酶。组成酶是细胞固有的酶,其合成是在相应的基因控制下进行的,它不因分解底物或其结构类似物存在而受影响。不论在什么培养基上生长都有相当的浓度。诱导酶是细胞为适应外来底物或其结构类似是、物而临时合成的一类酶。一般情况下不合成,只有在其底物或结构类
10、似物存在时才合成。能促进诱导酶产生的物质称为诱导物,它可以是该酶的底物,也可以是底物类似物或底物前体物质。诱导的作用:使微生物增强了对环境的适应能力,对于酶 本身来说,需要时合成,不需要时就不合成,避免了合成原料和能量的浪费。酶合成的诱导类型:A 同时诱导:即当诱导物加入后,微生物能同时或几乎同时诱导几种酶的合成,它主要存在于短的代谢途径中。B 顺序诱导:即先合成能分解底物的酶,再依次合成分解各中间代谢物的酶,以达到对较复杂代谢途径的分段调节。酶合成的阻遏:凡能阻碍酶生物合成的现象,称为阻遏。分末端产物反馈阻遏和分解代谢物阻遏。末端产物反馈阻遏(又称为葡萄糖效应):由于某种代谢途径末端产物过量
11、积累而阻止整个代谢途径酶合成的现象。分解代谢物阻遏:指细胞内同时有两种分解底物(两种碳源或两种氮源)存在时,利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的那种底物的有关酶合成的现象。特点:与调节酶活性反馈抑制等相比,它通过调节酶合成(即产酶量)实现代谢调节,是较间接而缓慢的调节方式。优点:则是通过阻止酶的过量合成,有利于节约生物合成的原料和能量。在正常代谢途径中,酶活性调节和酶合成调节两者(关系)是同时存在且密切配合、协调进行的。酶活性的调节是指一定数量的酶,通过其分子构象或 分子结构的改变来调节其催化反应的速率。影响因素底物和产物的性质和浓度;环境因子(如压力、pH、离子强度和辅助因子等);其他的酶的存
12、在。调节方式激活已有酶的活性;抑制已有酶的活性;激活:在激活剂的作用下,使原来无活性的酶变成有活性,或使原来活性低的酶提高了活性的现象。代谢调节的激活作用:主要是指代谢物对酶的激活。抑制:由于某些物质的存在,降低酶活性的现象。反馈抑制(feedback inhibition):反馈抑制是指代谢的末端产物对酶(往往是代谢途径中的第一个酶)活性的抑制。不同发酵时期染菌对发酵的影响:1、种子扩大时期染菌:危害大,如发现染菌后应灭菌后弃去。2、发酵前期染菌:易使杂菌迅速繁殖,与生产菌争夺营养和氧分。因此,应迅速重新灭菌,再接种,进行从头发酵。3、发酵中期染菌:将严重干扰生产菌的代谢,影响产物的合成。因
13、此,应做到 早发现、快处理。4、发酵后期染菌:如杂菌量不太多,可继续进行发酵;如污染量大,可提前放罐。此期染菌对不同产物的影响不同:如抗生素、柠檬酸影响不大;而肌苷、肌苷酸、谷氨酸等将影响产物的产量、产物提取和产品质量染菌的检查方法显微镜检查平板划线培养检查法或斜面培养检查法肉汤培养检查法从发酵过程的异常现象判断是否染菌显微镜检查细菌用革兰氏染色,必要时进行芽孢染色和鞭毛染色,然后再显微镜下观察。霉菌、酵母菌可直接观察。优点:简单、直接,是最常用的检查杂菌的方法之一。缺点:杂菌污染要等到繁殖一定的数量才能镜检,对发酵周期较短的生产菌判断其早期污染很不利,往往需要和其他方法结合。平板划线培养检查
14、法或斜面培养检查法先将待检样品在无菌平板上理线,要所可能的污染类型分别置于37和27下进行培养,一般8h后即可观察是否染菌肉汤培养检查法将待检样品接入无菌肉汤培养基中,分别置于37和27下进行培养,随时观察微生物生长情况,并取样镜检,判断是否染菌。适于液体培养基检查。从发酵过程的异常现象判断是否染菌根据发酵过程中的溶解氧、pH、排气中CO2含量、发酵液黏度、菌体酶活力等的异常变化来判断是否染菌。杂菌污染途径及预防(一)种子带菌的原因及防止(1)培养基及用具灭菌不彻底 原因:菌种培养基及用具灭菌均在杀菌锅中进行,造成灭菌不彻底的原因是灭菌锅内空气排放不完全,造成假压,使灭菌时温度达不到要求。防止
15、方法:灭菌时锅内排气完全(2)菌种在移接过程中受污染原因:当菌种移接操作不当,或无菌室管理不严,就可能引起污染防止方法:合理设计无菌室,严格无菌室管理制度,严格无菌操作接种(3)菌种在培养过程或保藏过程中受污染原因:菌种在培养或保藏过程中,由于外界空气进入,使杂菌进入而受污染。防止:试管棉塞应有一定松紧度,不宜太松且有一定的长度;培养和保藏温度变化不宜太大;每一级种子经检查合格后才能使用。(二)无菌空气带菌及防治原因:在好氧发酵中通入的无菌空气带菌是发酵污染菌的主要原因之一。防止:空气净化流程和设备的设计要合理,过滤介质的选用和装填过滤介质的灭菌和管理等方面都要适用、有效、合理。(三)设备渗漏
16、或设备、管道存在“死角”造成的染菌及防治(1)、设备渗漏引起的染菌及防治原因:发酵设备、管道、阀门的长期使用,由于腐蚀、磨擦和振动等原因,往往造成渗漏,从而引起染菌。防止办法:选用优质材料,并经常进行检查。如冷却蛇管的微小渗漏不易被发现,可以压入碱性水,在可疑的地方,用浸湿的酚酞指示剂的白布擦,如有渗漏时白布即显红色。(2)、设备、管道存在“死角”造成的染菌及防治:“死角”:由于操作、设备结构、安装或人为造成的屏障等原因,引起蒸汽不能有效到达或不能充分到达预定应该达到的局部灭菌部位,从而不能达到彻底灭菌的要求。这些部位即为“死角”。“死角”可以是设备、管道的某一部位,也可以是培养基或其它物料的
17、某一部分,如发酵罐中可存在许多死角。不锈钢衬里破裂形成“死角”。发酵罐底部培养基的沉积污垢形成“死角”。管道转弯处形成“死角”。法兰连接不当造成“死角”。(四)培养基灭菌不彻底导致染菌及防治(1)、原料性状 原因:稀薄的培养基易灭菌彻底;而淀粉质原料特别是有颗粒时易灭菌不彻底或是升温过快或混合不均时,易结块,使中心部位在灭菌时“夹生”,导致在发酵过程中团块散开而染菌。 防止措施:淀粉质培养基以实罐灭菌为好,在升温时先搅拌均匀,并加入一定量的a淀粉酶进行液化,并将原料大颗粒筛去。(2) 原因:实罐灭菌时未充分排除罐内空气,此种情况造成“假压”使罐顶局部温度达不到灭菌要求,导致灭菌不彻底而污染。
18、防止措施:在实罐灭菌升温时,应打开排气阀门有关相连接管的边阀、压力表接管边阀等,使蒸汽通气达到彻底灭菌。(3) 原因:培养基连续灭菌时蒸汽压力波动大,培养基未达到灭菌温度,导致灭菌不彻底而受污染。 防止措施:培养基连续灭菌时应严格控制灭菌温度,最好采用自动控制装置。(五)操作不当造成染菌: 原因:在发酵过程中由于操作不当而引起杂菌污染:如移种时或发酵过程,罐内压力跌零,使外界空气进入而染菌;泡沫顶盖而造成污染;压缩空气压力突然下降,使发酵液倒流入空气过滤器而造成污染等等。防止措施:科学严密的管理,加强工人技术培训和责任心的教育, 提高工人的素质。(六)噬菌体染菌及防治。1、污染原因:菌种本身带
19、噬菌体,特别是溶源性噬菌体,这种菌种一经发现,应立即弃去。生产的环境中有噬菌体。2、预防措施最有效的方法是以净化环境为中心 的 综合防治法。决不使用可疑菌种。清除周围环境中存在的噬菌体。能灭菌的灭菌,能消毒的消毒,消灭污染源,搞好清洁卫生工作。选育抗噬菌体菌株,使用抗噬菌体的菌种。做到种子本身不带噬菌体,轮换使用不同类型的菌体。注意通气质量。取风口应设在3040米的高空,空气过滤器要能保证无菌空气的质量。改进提高空气的净化度、保证纯种培养。改进设备、装备、消灭“死角”,药物防治等措施。四:液体培养基的灭菌(1)湿热灭菌法方法:它比干热灭菌法更有效,这一方面是由于湿热易于传递热量,另一方面是由于
20、湿热更易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构,从而加速其变性。(2)实罐灭菌(分批灭菌):将配置好的培养基置于发酵罐或其他装置中,通入蒸汽将培养基和所有设备一起进行加热灭菌的操作过程。,(3)连续灭菌(又叫连消)将配制好的培养基在向发酵罐输送的同时进行加热、保温和冷却等灭菌操作的过程。五: 固体培养基的灭菌(1)固体培养基现主要采用旋转蒸煮锅(灭菌蒸汽压力0.098MPa,维持2030min)进行灭菌,实现了机械化(过去手工操作)。(2)主要用于:固体曲、固体发酵原料的灭菌(3)固体培养基的特点:呈片状或粒状,不易翻动,吸水后加热易成团,冷却困难(故旋转蒸锅较适合它的特点)。(4)设备结构:旋转蒸
21、煮锅有单头(出口)和双头两种,由钢板焊制能承受一定压力,锅中心有空心横轴,轴则装在支架两端的轴承中,借齿轮转动。六:过滤除菌(1)过滤除菌是将液体或气体用微孔薄膜过滤,使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留,从而达到除菌目的。(2)无菌空气制备流程(对应的设备):空气(前置空气过滤器)进行粗滤(空压机)升压(一级冷凝器)对压缩空气降温(二级甚至多级冷凝器)降温(油水分离器)除水、除油 (空气加热器)降低湿度 空气储罐稳压(空气过滤器)除菌 无菌空气进入(发酵罐)一、种子扩大培养种子的扩大培养就是把保藏的菌种,即砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化,再经过扁瓶或三角瓶和种子罐,逐
22、级扩大培养后达到一定的数量和质量的纯种培养过程。这些纯种的培养物称为种子。 二、种子扩培的一般步骤:将砂土管或冷冻干燥管内保藏的菌种以无菌的方式接种至适合的斜面培养基上 进行活化培养。将生长良好的斜面孢子或菌丝转种到扁瓶固体培养基或药瓶液体培养基中扩大培养完成实验室种子制备。将扩大培养的孢子或菌丝体接种到一级种子罐,制备生产用种子。制备好的种子转种至发酵罐中进行发酵。三、影响种子质量的因素有:原材料质量:即用于制备种子的原材料质量。培养温度:尤其是斜面的培养温度。湿度:斜面的湿度。通气与搅拌:种子罐培养时的通气量。斜面冷藏时间:越长其生产能力下降越多。培养基:一般要碳源少些,氮源多些,有利于菌
23、体的培养。但要进行优选和对比试验确定。pH值:要适宜。以利于获得最大比生长速率和适当的菌体量,同时最后一级种子的培养基要与发酵培养基的pH值接近。四、接种龄与接种量(1).接种龄是指种子罐中培养的菌体从开始培养到接种至下一级罐时的培养时间。最适接种龄因菌种不同而有很大的差异。一般细菌种龄为724h,霉菌为1650h,放线菌为2164h等。一般最适的种龄应通过多次试验确定。(2).接种量指的是移入的种子悬浮液体积和接种后培养液体积的比例。不同微生物不同,一般霉菌发酵接种量为10%,多数抗生素发酵接种量为7%15%等。微生物的初级代谢:初级代谢、代谢调节、代谢控制初级代谢:初级代谢作用是生命活动的
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