利多卡因通过抑制NF-κB的活化减轻大鼠内毒素性肺损伤.doc
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1、利多卡因通过抑制NF-B的活化减轻大鼠内毒素性肺损伤徐州医学院附属医院麻醉科,江苏 徐州 221002封光 刘苏 王光磊 刘功俭* 摘要 目的:探讨利多卡因对大鼠内毒素性肺损伤的保护作用及其机制。方法: SD大鼠随机分为1) control组 (0.9% sodium chloride); 2) LPS组; 3) LPS +lido1mg/kg组; 4) LPS +lido2mg/kg组; 5) LPS +lido4mg/kg组,其中LPS组和LPS +lido4mg/kg组又根据腹腔注射内毒素到取肺组织或收集血液标本的时间分为1、3、6、12h亚组。Western印迹检测大鼠肺组织核内NF-
2、B和胞浆IB的表达,ELISA检测血清TNF-及IL-6的水平,观察大鼠肺组织病理变化。结果:大鼠腹腔注射内毒素后,肺组织核内NF-B的表达明显增多,血清TNF-及IL-6的水平明显升高,胞浆IB表达显著减少,病理切片示肺组织结构破坏严重。应用利多卡因后,与LPS组相比,核内NF-B的表达明显减少,胞浆中IB表达显著增加,血清中TNF-及IL-6的水平也明显降低,肺组织结构的破坏有明显减轻。结论:应用利多卡因能明显抑制内毒素引起的NF-B的活化和TNF-、IL-6的表达。提示利多卡因的肺保护作用机制可能与抑制NF-B的活化,进而抑制炎症反应有关,而利多卡因对NF-B活化的抑制可能与其抑制IB的
3、降解有关。SummaryBackground and Objectives: Lidocaine has been reported to attenuate the inflammatory response in addition to its anesthetic activity, but the mechanisms are poorly understood. The objective of this study is to determine if Lidocaine prior to endotoxemia diminishes pulmonary dysfunction b
4、y blocking the NF-kappa B activation. Methods: Rats were assigned to: 1) control (0.9% sodium chloride); 2) LPS; 3) LPS +lido1mg/kg; 4) LPS +lido2mg/kg; 5) LPS +lido4mg/kg. LPS and LPS+lido4mg/kg groups were subjected to 1h、3h、6h and 12h time point. To investigate the activation of NF-kappa B, the e
5、xpression of NF-kappa B in the nuclear and I kappa B alpha in the cytosol were analyzed by western blot. The concentration of TNF-alpha and IL-6 in serum was detected by ELISA. The pathologic changes of lung were observed using HE staining. Results: After i.p. injection of LPS, the expression of NF-
6、kappa B in the nuclear extracts was significantly increased and I kappa B alpha in the cytosol extracts was markedly decreased. The concentration of TNF-alpha and IL-6 in serum was increased. Pathological examination showed that the normal structure of lung was destroyed badly. However Lidocaine rev
7、ersed above results. Conclusion: Lidocaine attenuates LPS-induced lung injury via mechanisms involving inhibiting NF-kappa B activation and cytokines release, which implies Lidocaine may be as a potential anti-inflammatory agent in endotoxemia.利多卡因通过抑制NF-B的活化减轻大鼠内毒素性肺损伤摘要 目的:探讨利多卡因对大鼠内毒素性肺损伤的保护作用及其机
8、制。方法: SD大鼠随机分为1) control组 (0.9% sodium chloride); 2) LPS组; 3) LPS +lido1mg/kg组; 4) LPS +lido2mg/kg组; 5) LPS +lido4mg/kg组,其中LPS组和LPS +lido4mg/kg组又根据腹腔注射内毒素到取肺组织或收集血液标本的时间分为1、3、6、12h亚组。Western印迹检测大鼠肺组织核内NF-B和胞浆IB的表达,ELISA检测血清TNF-及IL-6的水平,观察大鼠肺组织病理变化。结果:大鼠腹腔注射内毒素后,肺组织核内NF-B的表达明显增多,血清TNF-及IL-6的水平明显升高,胞浆
9、IB表达显著减少,病理切片示肺组织结构破坏严重。应用利多卡因后,与LPS组相比,核内NF-B的表达明显减少,胞浆中IB表达显著增加,血清中TNF-及IL-6的水平也明显降低,肺组织结构的破坏有明显减轻。结论:应用利多卡因能明显抑制内毒素引起的NF-B的活化和TNF-、IL-6的表达。提示利多卡因的肺保护作用机制可能与抑制NF-B的活化,进而抑制炎症反应有关,而利多卡因对NF-B活化的抑制可能与其抑制IB的降解有关。 关键词:利多卡因;核因子-B;肿瘤坏死因子-;白细胞介素-6;内毒素;肺损伤急性肺损伤(ALI)/急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是由严重感染、创伤和体克等多种病因所致的弥漫性肺实质
10、损伤,其在分子水平上表现为众多促炎性细胞因子、粘附分子的过度表达,伴有多种炎症介质的产生。上述炎症形成级联反应,导致肺组织广泛损害,并累及诸多肺外器官,其中,核因子-B(NF-B)在调控炎症介质的基因表达上起着关键作用。多种炎症介质基因的启动子和增强子中含有B位点,如白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-(TNF-)等。活化的NF-B可调控上述介质基因的表达。最近的研究证明酰胺类局麻药利多卡因有着显著的抗炎特性1,2,3,因此本实验建立大鼠内毒素性肺损伤模型,探讨利多卡因对大鼠内毒素性肺损伤的保护作用及其机制4-6。 材料与方法实验动物及主要试剂:雄性SD大鼠(
11、由徐州医学院实验动物中心提供)250300g,LPS(E. Coli 0127:B8)购自sigma公司,NF-B p65 多克隆抗体, IB(NF-B阻遏蛋白)多克隆抗体(Santa Cruz公司),TNF-及IL-6酶联免疫(ELISA)试剂盒(美国R&D公司),利多卡因(第二军医大学朝晖制药厂),HE染液(江苏海门碧云天公司)。SD大鼠随机分为1) control组 (0.9% sodium chloride); 2) LPS组; 3) LPS +lido1mg/kg组; 4) LPS +lido2mg/kg组; 5) LPS +lido4mg/kg组,其中LPS组和LPS +lido4
12、mg/kg组又根据腹腔注射内毒素到取肺组织或收集血液标本的时间分为1、3、6、12h亚组。参照Sabrina M. Heidemann的实验7,采用腹腔注射LPS 8mg/kg(5mg/ml)制作内毒素性肺损伤模型,control组注射同体积的生理盐水。LPS +lido组在注射腹腔注射内毒素前10min,尾静脉注射利多卡因4mg/kg(10mg/ml),而LPS组和control组给予同体积的生理盐水。按分组规定的时间点,10水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉,取出肺组织。右肺下叶,-80冻存,用于Western印迹分析,左肺上叶做石蜡切片用于HE染色病理切片。1、肺组织石蜡切片的制备:各
13、组实验大鼠分别在相应的时间点,采用 10水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉,经4多聚甲醛心脏灌注固定后,取左肺上叶,浸泡固定,常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切成4 mm厚的连续石蜡切片。2、蛋白质印迹(Western印迹)检测:从液氮中取出肺组织,加1.5 ml Buffer A (含10 mM HEPES, pH 7.9, 0.5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 50 mM NaF, 1 mM DTT, 30 mM b-phosphoglycerol, 1 mM Na3VO4, 1 mM benzamidine and enzym
14、e inhibitors: 0.5 mM PMSF, 10 g/ml aprotinin, 10 g/ml leupeptin, 10 g/ml pepstatin A and 1 mM PNPP)。用电动匀浆器高速匀浆(10秒6次),加入10%的NP-40 90 ml,剧烈振荡30 S,800 g15 min离心,上清液为胞浆部分。后在沉淀物中加入500 ml Buffer B (20 mM HEPES, pH 7.9, 20% glycerol, 0.42 M NaCl, 0.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT and enzyme inh
15、ibitors: 0.5 mM PMSF, 10 g/ml aprotinin, 10 g/ml leupeptin, 10 g/ml pepstatin A and 1 mM PNPP),4转摇30min,12,000 g15 min离心,取上清为胞核成分,胞浆和胞核测蛋白后分装,置-80冰箱待用。蛋白含量测定按改良Lowry法8,以牛血清白蛋白作为标准蛋白。按Gu等方法9作稍微改动,等量蛋白样品经10% 的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后,以干转法电转移至NC膜上,转移缓冲液为25 mM Tris, 192 mM甘氨酸,20%(v/v)甲醇, pH8.3,转移条件为稳流
16、:电流大小(A)=膜面积(cm2)2.5,时间30min。转移后的NC膜经3% BSA室温封闭3 h后加入适当稀释的一抗,室温4h或4过夜。用缓冲液(10 mM Tris, pH7.4,0.1 mol/L NaCl, 0.1%Tween-20)洗膜三遍,加入相应酶标二抗,37反应2h,缓冲液洗膜三遍。以NBT/BCIP显色,水洗终止反应。结果以UVP图像分析仪(Gene Company)分析处理。3.酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中TNF-和IL-6:收集血液标本,取出试剂盒平衡至室温(2025),浓缩洗涤液用双蒸水稀释1倍(至500ml),加入10l标准品,10l血浆于相应反应板孔中,
17、每孔加入40l Anti-rat TNF-Biotin 和 40l Anti-rat TNF- POD。轻轻混匀30秒,封住板孔,室温温育45分钟。洗板,甩尽板内液体,用洗板机洗涤反应板(每孔内加入洗涤液350l)5遍。每孔加入100l显色液,轻轻混匀10秒,室温温育20分钟,每孔加入100l终止液,轻轻混匀30秒;30分钟内在450nm处读OD值,以OD值为纵坐标,以标准品浓度为横坐标,绘制标准曲线。根据血清样品的OD值在标准曲线上查出其浓度。IL-6的测量基本相同。4、肺组织病理检查:石蜡切片经常规脱蜡、水化。苏木素染液5分钟,浸自来水中冲洗掉多余的染液,约10分钟。蒸馏水再洗涤一次数秒,
18、95乙醇5秒,伊红染液30秒,常规脱水、透明、封片后,光镜下观察肺组织形态学变化。5、统计学处理: 数据以均数标准差(meanSD)表示,统计分析采用单因素方差分析(ANOVA),多个实验组与一个对照组比较用最小显著差法(LSD),实验组之间比较采用q检验(Newman-keuls test),p0.05为统计学有显著性差异。结果1. Western印迹检测NF-B表达结果(图.1):control组大鼠肺组织的细胞核内中仅见有微量NF-B的表达;LPS组核内NF-B的表达量从注射内毒素后1h就开始显著增加,3h达到高峰,6h已经有所恢复,但直到12h仍显著的高于control组;在LPS +
19、lido4mg/kg组,应用利多卡因后能明显的抑制内毒素引起的核内NF-B的表达。和LPS组相比,LPS +lido4mg/kg组在1、3、6、12h四个时间点核内NF-B的表达量都显著的低于LPS组。control - + - + - + - + lidocaine1h 3h 6h 12hAnti-p65(a)Fig.1(b)图.1 NF-B在大鼠肺组织细胞核中的表达水平(s, n=6)注:与control组相比,*P0.05;同一时间点与LPS组相比,# P0.052. Western印迹检测IB(NF-B阻遏蛋白)的表达结果(图.2):大鼠注射内毒素后1h,肺组织胞浆中IB的表达量就开始
20、显著的下降,3h和6h处于较低水平,12h IB的表达量也显著的小于control组;和LPS组相比,LPS +lido4mg/kg组在1、3、6、12h四个时间点IB的表达量都显著的高于LPS组,应用利多卡因能显著抑制内毒素引起的胞浆IB的降解。Control - + - + - + - + lidocaine1h 3h 6h 12hIB(a)Fig.2(b)图.2 IB在大鼠肺组织细胞浆中的表达水平(s, n=6)注:与control组相比,*P0.05;同一时间点与LPS组相比,# P0.053. 肺组织病理切片的结果(图.3):control组在光镜可见肺泡结构完整,肺泡壁无水肿,无炎
21、症细胞浸润;LPS组可见片状出血,光镜下可见基本上看不到完整的肺泡结构,肺间质有严重的水肿、淤血,大量的炎症细胞浸润;LPS +lido4mg/kg组,肺泡结构受到轻微破坏,能看到代偿增大的肺泡,无明显的水肿、淤血,仅有少量的炎症细胞浸润。(E)(B)(A)Fig.3(C)(D)图.3 腹腔注射内毒素后6小时的病理(HE400)注:(a) control group; (b) LPS group; (c) LPS+lido1mg/kg group; (d) LPS+lido2mg/kg group; (e) LPS+lido4mg/kg group4. ELISA检测血清中TNF-和IL-6的
22、结果(图.4、图.5):在LPS组,腹腔注射LPS后,血清中TNF-和IL-6的水平均显著升高,TNF-的水平于3h达到高峰,而IL-6的水平则随着时间的延长逐渐升高;和LPS组相比,LPS+lido4mg/kg group在1、3、6、12h四个时间点TNF-和IL-6的表达量都显著的低于LPS组,应用利多卡因能显著抑制内毒素引起的血清TNF-和IL-6的升高。Fig.4图.4 大鼠血清TNF-的表达水平(s, n=6)注:与control组相比,*P0.05;同一时间点与LPS组相比,# P0.05Fig.5图.5 大鼠血清IL-6的表达水平(s, n=6)注:与control组相比,*P
23、0.05;同一时间点与LPS组相比,# P0.055. Western印迹检测不用剂量利多卡因下NF-B的表达结果(图.6):应用2mg/kg和4mg/kg的利多卡因都可以明显的抑制内毒素引起的核内NF-B表达的增多。其中以4mg/kg时,利多卡因的这种抑制作用最为明显。Anti-p65Control LPS 1 2 4 lidocaine(mg/kg)Fig.6(a)(b)图.6 NF-B在大鼠肺组织细胞核中的表达水平(s, n=6)注:与control组相比,*P0.05;同一时间点与LPS组相比,# P0.056. Western印迹检测不用剂量利多卡因下IB的表达结果(图.7):应用2
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