十字花科黑腐病菌中一个假定双组份系统的表达和磷酸传递研究.doc
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1、I 十字花科黑腐病菌中一个假定双组份系统的 表达与磷酸传递研究 摘 要 双组份系统是微生物重要的信号转导途径,在感知环境刺激后,通过 磷酸传递的方式将信号传递至胞内,从而产生应答调控功能;十字花科黑 腐病菌(Xanthomonas campestris pv. campestris,Xcc)8004,是研究微生物与 植物相互作用的重要模式菌,全基因组测序已经完成,其中注释为双组分 系统的基因有 106 个。XC3669,XC3670 分别注释为应答调节蛋白和组氨 酸激酶,是一个假定双组份系统。XC3670 位于 XC3669 下游,两个 ORF 间隔 4bp。同源性分析表明,XC3670-XC
2、3669 很保守,在许多已测序的微 生物基因组中都存在其同源基因对,DNA 序列分析表明原始 XC3670 的 G2 box 被一段插入序列所隔开,该插入序列编码两个 IS1404 转座酶,为 重叠基因。本实验中,分别构建了 XC3670/XC3670C、XC3669/XC3669N 和 HrpG 的 pET-30a(+)/ pQE-30 Xa 表达载体,在 E.coli BL21(DE3) /M15pREP4中表达,同时对 HrpG 的可溶性表达进行优化,通过调节诱 导温度、IPIG 浓度和诱导时间最终确定 HrpG 的最优表达条件为 20、 IPTG 浓度 0.8 mM、诱导时间 4 h,
3、此时 HrpG 在破胞上清液的可溶性表达 状况最好。纯化重组蛋白进行 in vitro 磷酸化实验,结果表明 XC3670 具有 自激酶活性,能够接受-32PATP 的磷酸基团,去除 HAMP 和 PAS 结构 域后(XC3670C),对 XC3670 的活性不产生影响。分别检测了肉桂酸、FAD 及黑暗条件等对磷酸传递的影响,结果没有检测到磷酸基团从 XC3670/ XC3670C传递至 XC3669/ XC3669N;使用 cross-talk 方法验证 XC3670/ XC3670C和其他 12 个应答调节蛋白的磷酸传递,结果表明没有检测到磷 II 酸传递。分析可能是由于 XC3670 由
4、于在进化过程中的插入突变或其本身 的严谨性以及其他原因导致磷酸传递未发生。 关键词:关键词:十字花科黑腐病菌 双组份系统 插入序列 磷酸传递 III EXPRESSION AND PHOSPHOTRANSFER ANALYSIS OF A PUTATIVE TWO-COMPONENT SYSTEM IN XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV. CAMPESTRIS ABSTRACT Two-component system(TCS) plays important role in signal transduction pathways of microorganisms. Af
5、ter perceiving environment stimulus , signal is transducted to cytoplasm by phosphotransfer mechanism, resulting in response regulation accordingly. Xanthomonas campestris pv.campestris (Xcc) 8004 is one of the model bacteria in studying the interaction between microbes and plants, its genome has be
6、en sequenced, including 106 genes annotated two- component system proteins. XC3670-XC3669 which is annotated histidine kinase(HK) and response regulator(RR) respectively, is a putative two- component system. XC3670 is located downstream of XC3669, with only 4 nucleotides between them. Homology analy
7、sis shows that XC3670-XC3669 unit is conserved, and their homologies are found in many sequenced genomes. DNA sequence analysis showed that the G2 box was isolated from kinase core of ancestor XC3670 by a insertion sequence which encodes two IS1404 transferases which are over-lapped genes. In this e
8、xperiment, XC3670/XC3670C, XC3669/XC3669N andhrpG are constructed pET-30a(+)/pQE-30 Xa expression vector respectively, and are expressed in E. coli BL21(DE3)/ M15pREP4. In order to optimize the expression ofhrpG, tempreture, IPTG concentration and time for induction is optimized, respectively. Expre
9、ssion of solublehrpG in supernatant of cell disrution is best while combination E.coli M15pREP4 is induced at 20 for 4 h with IPTG concentration 0.8 mM. Constructed proteins are purified for in vitro phosphorylation. Result shows XC3670/XC3670C is IV autokinase that can be phosphorylated by receving
10、 phosphoryl group from - 32P, and lack of HAMP and PAS domains(XC3670C) does not affect XC3670 activity. Subsequently analysis shows that, no phosphotransfer is detected from XC3670/XC3670C to XC3669/XC3669N, while chromophore, FAD and dark conditions is carried out respectively. Cross-talk analysis
11、 shows that no phosphoryl-transfer activity is detected of XC3670/XC3670C. This result demonstrates that maybe the insert-mutation of ancestor XC3670 and other reasons leading to the failure of phosphotransfer of XC3670. KEY WORDS: Xanthomonas campestris pv. campestris; two-component system; inserti
12、on sequence; phosphotransfer V 目 录 第一章 前 言 .1 1.1 双组份系统 1 1.1.1 概述.1 1.1.2 TCS 磷酸传递方式.2 1.2 组氨酸激酶 6 1.2.1 结构域.6 1.2.2 HK 的活性.6 1.2.3 激酶核心的结构与功能.8 1.2.4 结构域特征和 HK 分类.9 1.2.5 信号转导的机制.10 1.3 应答调控蛋白 10 1.3.1 结构域组合.10 1.3.2 REC 结构域活性.11 1.3.3 REC 的结构和功能.11 1.3.4 REC 分类.12 1.3.5 RR 调控机制.13 1.4 十字花科黑腐病菌 80
13、04 中的 TCS13 1.4.1 Xcc 8004 TCS 概况.13 1.4.2 Xanthomonas 中已研究的 TCS.15 1.4.3 hrp 基因簇研究进展.15 1.5 本研究的目的、内容和意义16 1.5.1 本研究的主要目的.16 1.5.2 本研究的主要内容.16 1.5.3 本研究的主要意义.16 第二章 材料与方法.18 2.1 材料 18 2.1.1 菌株与质粒.18 2.1.2 试剂和制剂18 VI 2.1.3 培养基.20 2.2 方法 21 2.2.1 微生物操作.21 2.2.2 DNA 分子操作22 2.2.3 蛋白质分子操作.24 2.2.4 生物信息学
14、方法.26 第三章 结果与分析.27 3.1 生物信息学分析.27 3.1.1 结构域简述27 3.1.2 DNA 序列分析27 3.1.3 hrpG 基因组定位28 3.1.4 HrpG 理化性质及结构域分析 .28 3.1.5 HrpG 同源性分析 .30 3.2 重组蛋白表达及纯化.31 3.2.1 重组蛋白的表达31 3.2.2 12 个 RR 重组蛋白的表达.32 3.2.3 HrpG 重组蛋白的表达与优化 .32 3.3 in vitro 磷酸化传递实验 35 3.3.1 XC3670 自磷酸化和磷酸传递.35 3.3.2 cross-talk 验证磷酸传递.36 第四章 结论与讨
15、论.38 4.1 假定 TCS.38 4.2 激酶缺失 G2 box38 4.3 HAMP/PAS 结构39 4.4 应答调节蛋白.39 4.5 HrpG 的表达.40 4.6 磷酸传递.41 参考文献.44 致 谢.57 十字花科黑腐病菌一个假定双组份系统的表达和磷酸传递 1 第一章前 言 1.1 双组份系统 1.1.1 概述 面对环境中各种因素的影响,细菌在生存过程中需要及时作出相应调整,这对于 维持其正常生长和繁殖是非常重要的。由于自身复杂程度和生存环境的差异,不同微 生物响应环境变化的途径和和方式各有不同,概括起来主要有以下几种:趋化性受体 系统1 (chemotaxis recept
16、or)、抗-因子系统2(anti- factor pair)、Ser/Thr/Tyr蛋白激酶 系统3 (Ser/Thr/Tyr protein kinase,SKS)和双组份系统4(Two-component system,TCS)。 同种微生物中可能同时存在上述几种信号系统,这与其生存能力相对应。总的来看, 在微生物特别是原核生物中,TCS在这几种信号体系中占主导地位。 顾名思义,TCS 由两部分构成,一个是组氨酸激酶(histidine kinase,HK),通过感 应结构域来感知环境信号,并将信号向胞内传递;另一个是同源的应答调节蛋白 (responsse regulator,RR),用
17、于接收来自 HK 的信号并启动调节功能5。TCS 信号的转 化是以磷酸传递的方式进行的,HK 催化 ATP 的磷酸基团转移,发生自磷酸化反应, 并将磷酸基团传递至同源 RR 的上,经磷酸化后,RR 发生构象转变为激活状态,启动 相关的调控机制。事实上,TCS 的结构存在多样性,在复杂的 TCS 中,磷酸传递呈现 多级(磷酸接力)甚至是分支交叉形式(cross-talk)而不仅是两个组分之间的信号转导。这 一方面反应了微生物中信号调控的多样性和复杂性,另一方面也显示了微生物适应环 境、应对环境改变的能力。 由于微生物自身和栖息环境等原因,不同细菌之间的TCS数目和结构复杂程度差 别很大,且呈不均
18、匀分布,但基本上与基因组大小呈正比6。一般而言,自养微生物的 TCS数量要比寄生型多,高等微生物的TCS比低等的复杂7。前者是因为营寄生生活的 微生物生存环境稳定,不需要应对过多的变化刺激,所以信号系统比较少;而自养型 微生物生存环境复杂多变,其信号传导和调节机制比较完善。TCS的数量和复杂程度 反映了细菌适应环境的能力和信息调节的严谨完善程度8。 十字花科黑腐病菌一个假定双组份系统的表达和磷酸传递 2 TCS 最早在 E. coli 中得以阐述,随着研究的深入,逐渐发现 TCS 参与调节各种 不同的信号应答,包括环境温度、pH、渗透压,细菌的趋化性、感光性和致病性、孢 子形成等生理生化过程。
19、进一步研究表明,在细菌的营养(C、N、P)吸收与代谢、离子 应答(如 Mg2+、Cu2+、Ni2+、NO2-、NO3-)、小分子吸收与代谢(O2、苹果酸、延胡索酸、 草酰乙酸、柠檬酸、四硫磺酸、葡萄糖、6-磷酸葡萄糖、谷氨酰胺、N-氧化三甲胺)、 蛋白折叠纠错、胞内电势与还原态、物质分泌和细胞分化、细胞密度、细胞抗性(阳离 子抗微生物肽、细胞壁活性抗微生物肽、杆菌肽)、聚膜形成、节律周期、全局感应(自 诱导肽、感应态刺激肽、融合信号因子、壁压刺激因子)及胞间交流等方面发挥了重要 作用9-17。 TCS不仅在原核生物中广泛存在,在低等真核微生物和植物中都有发现18。与原 核生物中的TCS相比,真
20、核中的TCS更加复杂,表现在HK序列的多结构域,信号传递 的多步骤和信号途径的多交叉与整合上,这和真核生物自身结构和信号途径的复杂多 样性相关。这种差异可以通过SKS与TCS的对比进行阐述,与TCS相似,SKS在原核和 真核生物中也均存在,但原核生物中的SKS结构简单,数量较少;而真核生物中,SKS 占主导地位,且结构功能复杂。在高等脊椎动物中TCS完全不存在,而SKS成为一种重 要的信号传导机制19。有趣的是在一些低等真核生物如酵母中,信号经TCS传递之后 并不直接行使调控功能,而是继续传递给SKS,最终完成信号应答20。这种TCS-SKS 之间信号传递的延续与整合体现了生物信号系统的进化趋
21、势及自身对环境的适应的能 力。 随着新型测序方法的推出和大规模测序的不断进行,越来越多的基因组序列得以 揭示,到目前为止,通过生物信息学及实验研究发现的TCS基因已达81988个21,这个 数目还在不断增加。这一方面为进行TCS相关研究提供了大量材料,另一方面也向TCS 的研究方法和理论提出新的要求,随着研究的不断深入,生物和环境之间的相互作用 机制将进一步得以明确。 1.1.2 TCS 磷酸传递方式 TCS 中信号的转导是以磷酸基团传递的方式进行,由于生物系统的多样性,磷酸 传递也以多种方式进行,主要包括 His-Asp、His-Asp-His-Asp 和 cross-talk 三种方式22
22、- 23。 十字花科黑腐病菌一个假定双组份系统的表达和磷酸传递 3 1.1.2.1 His-Asp 途径 来自于ATP的-磷酸基团经HK的His残基直接传递至RR的Asp残基,即His-Asp传递 是TCS最简单的转导方式,见图1-1(a)。 (a)(b) 图1-1 TCS信号传递模式图23 注:(a)典型的TCS,其胞外感应器接受信号后,经跨膜结构(TMI, TM2), 传递至胞内,经CA域催化 结合的ATP,将磷酸基团转移至DHp域的His(H)残基上,发生自磷酸化,然后磷酸基团传递至RR的 REC的保守Asp(D)残基上,通过自身构象改变导致效应域(Effector)激活,引起下游应答。
23、(b)复合型 TCS的信号传递是以磷酸接力(His-Asp-His-Asp)的方式进行的,HisKA域的His残基发生磷酸后磷酸 基团依次转移至中间REC和磷酸转移酶结构域(HPt)上, 最后传递至RR的REC上。此外,其胞内 TM区域的C 端常连接有附加结构域,如PAS、HAMP及GAF等,效应结构域的功能 包括结合DNA/RNA 、酶催化、结合蛋白等,某些情况下可能不存在效应结构域 Figure1-1 Ideograph of TCS signal transduction Note: (a)classical TCS, after periplasimic sensor domain d
24、etects the signal, signal transmitted to cytoplasm through transmenbrans structure.CA domain catalyze the binding ATP, leading to the autophosphorylation of HK. Then ,phosphoryl group is transferred to Asp residule of REC domain in RR, which will resulting in the conformation change of effector doma
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