台湾特产珍稀药用真菌樟芝的深层发酵与产品开发项目计划书.doc
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1、台湾独有珍稀药用真菌樟芝液态发酵产业化及其产品开发项目计划书一、 项目的目的及意义樟芝(Antrodia cinnamomea)又称牛樟芝,牛樟菇,樟内菇等,是台湾特有的珍贵药用真菌,仅生长在中国台湾山区海拔450-2000米之间的牛樟树腐朽的空心内壁,具有强烈的黄樟气味。樟芝含有多种生理活性物质,如多糖,三萜类,超氧化物歧化酶,腺苷,维生素,微量元素锗和氨基酸等,其中多糖和三萜类化合物是其主要的生理活性物质,具有免疫调节、抗肿瘤、保肝、抗病毒、保护神经系统、抗高血压、抗高血脂、抑菌、抗辐射、抗氧化、抗炎症,抗衰老等多种生物活性,可以广泛的应用于医药,食品,化妆品,日化等领域。樟芝自然生长条件
2、苛刻,生长缓慢,此外不法商人的滥采滥伐,导致野生樟芝资源严重短缺和价格的一路飙升。人工栽培面临不能获得樟芝子实体,不易除去不可食用部分,易染菌,周期长等问题。而樟芝深层液态发酵产物富含各种生理活性物质,几乎无毒副作用,易于大规模人工生产。因此采用现代发酵工程技术来生产樟芝的有效物质是开发樟芝,造福人类的最经济,最有效,最环保的方法。 在前期已完成深层液体发酵试生产的基础之上,本项目拟采用投融资,项目整体转让,合作开发等方式建立樟芝深层液态发酵生产线一条,同时展开后续研发实验,开发以樟芝为原料的日化产品2-3个,健康产品2-3个,药品1-2个,最终填补国内空白,为这一珍稀资源的开发和利用开辟新的
3、途径。二、国内外技术发展现状与趋势2.1 樟芝的生物学特性樟芝又称樟生薄孔菌、牛樟菇、牛樟芝、红樟芝、血灵芝、樟内菇、红樟菰等,属于担子菌亚门,层菌纲,非褶菌目,多孔菌科,薄孔菌属,属台湾独有物种。子实体多年生,平伏无柄,木栓质至木质,多附着于牛樟树中空心材内壁上生长。子实体菌肉两层,初生时表层(上层)鲜红色,渐长为白色、淡红褐色、淡褐色或淡黄褐色,下层淡黄色;老熟后成钟状,皮壳黄褐色至黑色,外皮有明显的环状构造,质地极其坚硬。子实体形态多变化,有板状、钟状、马蹄状或塔状,一般以板状居多。新鲜或干老樟芝子实体有浓郁的香樟味,整面充满菌孔(45个mm2 ),不规则,菌管孔口乳黄色,管口近圆形,内
4、有孢子,味极苦。生殖菌丝透明微黄,壁薄,有锁状联合:骨架菌丝淡黄色,壁厚到近实心。樟芝仅生于台湾深山(海拔4502 000m)特有的“国宝”级树种 百年以上的牛樟树(Cinnamomum kanehirai)上,生于空心树干之心材内壁(树干空洞)的称为樟窟内芝,少数生于枯死倒伏之牛樟树木材潮湿面的称为樟外芝。樟芝生长极为缓慢,生长期也仅限于每年的6至1O月,形成子实体的时间相当长,其生长环境均属于幽暗、潮湿且温度稍低之中海拔地区。樟芝主要分布在台湾桃园复兴乡、角板山,苗栗南庄乡、三湾乡,南投竹山镇、水里乡,屏东县六龟乡、高雄旗山等区域之海岸山脉阔叶林内。2.2 樟芝的学名以及分类学历史1990
5、年,中国科学院昆明植物研究所的臧穆与台北医学院的苏庆华共同署名发表我国台湾产灵芝属一新种樟芝Ganoderma camphoratum M.Zang & C.H.Su。因当时模式标本(标本号HKAS 22294) 在实验室中沾染了灵芝类的孢子,以致将灵芝孢子描述成樟芝的孢子,误作为灵芝属的新种类;同时。认为其寄主是香樟Cinnamomum camphora。这篇论文在刊印时将“camphoratum” 及“camphora”中“cam-”误排为“com-”。1995年,台湾省林业试验所张东柱等人根据樟芝子实体外观特征、气味、生长速度、孢子显微结构等研究结果,认为樟芝应归入多孔菌科的薄孔菌属An
6、trodia,将其学名订正为Antrodia cinnamomea TTChang & WNChou (标本号TFRI 119),并指出其寄主应为牛樟Cinnamomun kanehirai。这个时期有关樟芝的研究文献中,有的还将樟芝的寄主认作沉水樟Cinnamomum micranthum (Hayata) Hayata。1997年,台湾自然科学博物馆的吴声华等人重新检验了樟芝标本HKAS 22294和TFRI 119,整合前两次文献中的一致内容,再次进行新种的修订,并按真菌分类中新种命名的原则,将樟芝学名订正为Antrodia camphorate ( M. Zang& C. H. Su)
7、 Sheng H. Wu, Ryvarden & T. T. Chang;把原定名人M. Zang & C. H. Su置前。并将张东柱等发表的Antrodia cinnamomea T. T. Chang& W. N. Chou处理为Antrodia camphorate 的同义名(即同物异名)。该新组合名发表后,为台湾学术界及产业界所接受。不过, 由于台湾省禁止樟芝物种外流。中国科学院微生物研究所真菌标本馆没有研究与保藏樟芝菌种或标本,故樟芝尚未收入中国真菌志多孔菌科。2.3 樟芝的民间应用情况樟芝疗效流传甚久,传说台湾原住民在采伐时,无意问发现生长于牛樟树上的樟芝。早期台湾原住民因长期喜
8、欢饮酒,导致罹患肝病的人数一直居高不下。后来他们发现,在喝过以樟芝熬煮的汤汁后,肝病竟会痊愈,并且体魄强健,因此,原住民每天外出时,都会含上一片樟芝。他们将樟芝视为最珍贵的药材,中药店视之为上好解毒剂,凡食物中毒、腹泻、呕吐、农药中毒均以樟芝作为解毒之用。它对改善肝、胃机能及治疗血液循环疾病均有良好功效。因此,樟芝药效被广泛宣传,在台湾地区称为“神芝”,相传在治疗肝癌上似乎特别有效,一般应用则可治疗急性腹痛、消炎、抗过敏、解毒保肝、强身,其解酒效力更是一流。但是由于樟芝作为新种于1990年才正式发表,且樟芝是台湾特有种,台湾政府禁止樟芝物种外流,加上历史造成两岸隔阂等因素,因此,在大陆传统的中
9、医资料中,始终未见有关樟芝的任何记载,故而开发相对非常的落后。2.4 樟芝的有效成分迄今为止,从樟芝子实体中已经分离得到70多种化合物,包括多糖、二萜类、三萜类、甾体类、苯环衍生物等,其中多数为新化合物。据报道,多糖、萜类和甾体类化合物为樟芝的主要活性化合物。A樟芝多糖目前对于樟芝多糖的研究主要集中于提高其产量和药理活性,对于多糖的分离纯化和结构特性研究报道较少。Huang等人发现樟芝发酵滤出液中多糖的组成主要为甘露糖,葡萄糖和木糖,和少量半乳糖和糖醛酸。但是樟芝菌丝体水提取物和碱液提物中多糖的主要组成单糖为葡萄糖和木糖。通过NMR、X射线和红外光谱测定,多糖分子量大约为106 kDa,其结构
10、具有-D-葡聚糖的结构。经证实,具有-1,3-D-葡聚糖骨架呈现螺旋形的结构,是多糖类物质具有抗肿瘤活性的必要结构。B樟芝三萜类化合物野生樟芝的味道极苦,其甲醇提取物的量高达30%,高达灵芝10倍,暗示着其所含三萜类化合物较多。Chen等人在1995年首次从樟芝子实体中分离得到了三种新的麦角甾烷型(ergostane)三萜类化合物Anticin A-C。1996年,Chen等人以相同的方法又发现四种新的三萜类化合物:actcin E-F、methyl antcinate G和methyl antcinate H。随后,多项研究报道证实了樟芝子实体中含有较多的三萜类化合物,且多数为新化合物。到目
11、前为止,共从樟芝中分离纯化得到30来种三萜类化合物,骨架结构主要以麦角甾烷和羊毛脂烷(lanostane)为主(表1)。樟芝子实体分离出的三萜类化合物的支链上均具24(28)-en的结构,表明樟芝三萜类化合物的代谢途径与常见的灵芝三萜可能有很大的不同。另一方面,目前绝大多数研究都是围绕从樟芝子实体中分离纯化得到的新化合物,对于人工培养的樟芝获得大量化合物研究鲜有报道。表1樟芝子实体、菌丝体和发酵液中分离鉴定的三萜化合物化合物 2.5 樟芝三萜的生物活性自从樟芝被报道以来,樟芝以独特的生物活性引起了人们的研究热情,截至到目前为止共发表了大约150篇的SCI研究论文。大量研究文献表明,樟芝菌有免疫
12、调节、抗肿瘤、保肝、抗病毒、保护神经系统、抗高血压、抗高血脂、抑菌、抗辐射、抗氧化、抗炎症等多种生物活性,具有很好的市场开发前景。由于篇幅限制,本文仅对成药性和市场前景最好的护肝,抑制乙肝病毒,抗肝癌等方面进行详尽的介绍(见表2)。表2 樟芝的护肝药理活性功能实验样品,剂量模型,实验设计结果参考文献保肝樟芝子实体或菌丝体 500mg,1000mg/kg.day酒精诱导急性肝损伤,雄性SD 大鼠,体内通过抗氧化对急性肝损伤有显著保护作用。Dai et al. (2003)樟芝子实体或菌丝体 500mg,1000mg/kg.day酒精诱导急性肝损伤,雄性SD 大鼠,体内1)能够显著降低大鼠血清AS
13、T,ALT,ALP,BIL 和TG (P0.05);2)能够抑制乙醇所致的MDA升高,并显著提高GSH 水平及GPx和GR活性(P0.05);3)显著改善经四氯化碳处理后引起的肝组织病变。Lu et al. (2007)樟芝20%酒精诱导慢性酒精性肝发炎,大鼠,体内能够显著降低TLR-4,5,7,9,伴随着其下游蛋白MyD88, MAPK pathway p-Erk, p-p38, PI3K, AKT及其产生的发炎因子的明显下降。Huang et al(1999)野生樟芝(25mg/kg.Day)20%酒精诱导酒精性脂肪肝,体内可以显著降低肝脏中胆固醇,脂肪的含量;可显著改变酒精伤肝代谢有关基
14、因的表现活性;可加强GSH,Trolox的抗氧化能力,降低肝脏中丙二醛的含量和降低血中转氨酵素的活性;肝组织受损程度大幅减轻。Huang et al(2010)牛樟芝水提物250,750,1250mg/ kg.day. 4day/week四氯化碳诱导急性肝功能障碍,雄性ICR 大鼠,体内通过显著降低抗氧化酵素(catala -se, SOD, TBARs等)的含量,且降低脂质过氧化的程度以达到保肝护肝的作用。Hsiao et al.(2003)樟芝菌丝体发酵液干燥物250mg,500mg/kg.day四氯化碳诱导急性肝功能障碍,雄性SD 大鼠,体内通过向上调节肝脏GSH依赖酶,维持正常的GSH
15、GSSH 比率和清除四氯化碳代谢产生的自由基,在防止肝脏系统的氧化损伤方面发挥显著作用。Song and yen.(2003)樟芝菌丝体发酵过滤液,3,12.4,24.8ml/kg. day四氯化碳诱导慢性肝功能障碍,体内对肝脏生理机能有明显的正面影响,可明显降低肝纤维化程度及变性程度,增加肝脏红血球中GSH含量及增加抗氧化酵素活性,降低肝脏脂质过氧化程度,而有利于体内氧化压力的下降。Chen et al.(2002)樟芝菌丝体(0.5,1.0 g/kg.day)四氯化碳诱导急性肝功能障碍,雄性WISTAR大鼠,体内能够显著抑制四氯化碳引起的肝纤维化进程。Lin et al.(2006)樟芝水
16、提取物,连续12周硫代乙酰胺诱导肝纤维化或者肝硬化,体内樟芝水提物能够有效降低肝损伤。Lee et al.(2005)樟芝菌丝体(0.25mg,100mg/kg,连续84天)二氯化汞处理,SD雄性大鼠,体内 1)可显著降低肝指数GPT,GOT;2)可显著提高抗氧化酵素GSH,GSHPx,GSH/GSSG以及catalase,SOD的活性;3)明显降低总胆固醇以及三酸甘油脂指数Chen et al.(1996)樟芝菌丝体多糖提取物(0.4,0.8g/kg.day) 痤疮丙酸杆菌和脂类多糖处理,雄性ICR 大鼠,体内能够显著降低大鼠血清AST,ALT。Han et al.(2006) 抑制乙肝病毒
17、5种樟芝菌种培养得到的子实体和菌丝体中提取出的多糖体(50g /ml)MS-G2细胞株,体外所有樟芝多糖均显示出较强的抗B型肝炎表面抗原作用,比干扰素1000 单位/ml的作用还强这些多糖体均无细胞毒作用。Lee et al(2002)樟芝子实体分离到的十个化合物(5-50m)HBV,HCC细胞株,体外采用活性追踪的方法分离的一个抗乙肝病毒的连苯类化合物Huang etal(2003)樟芝液体培养基(5-50m)HBV细胞株,体外采用活性追踪的方法分离的一个抗乙肝病毒的化合物Shen etal(2005)抗肝癌樟芝子实体的乙酸乙酯提取物(10-100g /ml)肝癌细胞Hep G2, PLC/
18、PRF/5,体外樟芝的抗癌机制包括1)诱导细胞程序性凋亡2)启动Hep G2肿瘤细胞Fas/Fas ligand 通道3)启动线粒体通道4)调节Bcl-2族蛋白5)抑制NF-kB的活化Hsu et al.(2005)樟芝菌丝体甲醇提取物(10-200g /ml)人体肝癌细胞Hep G2;体外通提升Fas/Fasl来活化caspase-8,-3以抑制肿瘤细胞的增生。Song et al.(2005a)樟芝菌丝体甲醇提取物(10-50g /ml)SD大鼠Hep G2,Hep3B肝癌细胞,体外通过提升caspase-8,-3来抑制肿瘤细胞的增生。Song et al.(2005b)樟芝子实体的乙酸乙
19、酯提取物(30-120g /ml)人类肿瘤细胞Hep 3B,体外通过调节钙离子,钙蛋白依赖通道来抑制肝癌细胞的增生。Kuo et al.(2006)樟芝子实体乙酸乙酯提取物(10-40g /ml)人类肿瘤细胞PLC/PRF/5,体外通过抑制NF-kB的活化来抑制肿瘤细胞的增生。Hsu et al.(2007)固态培养樟芝菌丝体乙醇提取物(100g,200g,400g,800g/ml)人体Hep 3B肝癌细胞,体外半数抑制浓度为574.55g/mlCai et al.(2005)樟芝合并其他抗肿瘤药物人体肝癌细胞,体外 肝癌细胞合并低浓度樟芝与不同作用机制的抗癌药物后,调节肝癌细胞中的抗药性相关
20、蛋白的表现而造成肝癌细胞的抗药性降低,造成药物更易进入肝癌细胞中,因而增加药物累计量,同时也降低了P-gp作用以减少药物排出量,最终使肝癌细胞走向凋亡。同时通过降低MDR表现以促进抗癌药物对细胞的毒杀作用。Huang et al(2006)固态培养樟芝菌丝体(50,100,200mg/ml)Hep 3B肝癌细胞以及,5-FU处理的免疫抑制BALB/c小鼠,体内能够显著提升免疫抑制小鼠的免疫力,能够显著减少老鼠身上的肿瘤大小,显著延长存活时间。Cai et al.(2005)固态培养樟芝菌丝体90%酒精提取物(1g/ml,0.2ml/只.天,每天2次,连续14天)Hep G2肝癌细胞,雌性NOD
21、大鼠,体内肝癌肿瘤小鼠的肿瘤生长缓慢,且肿瘤较小(p0.01),平均肿瘤小鼠的存活率延长70%,能够显著抑制肿瘤细胞的增生。Lin et al.(2008)固态/液态培养樟芝菌丝体提取物人类肝癌细胞C3A和PLC/PRF/5,体外;ICR裸鼠,C3A和PLC/PRF/5,体内樟芝提取物,通过与顺铂,丝裂霉素联用,可显著减少肝癌细胞数量,延长裸鼠存活时间。Chang et al(2008)提高免疫樟芝子实体(40,200,1000mg/kg.bw,1次/天,连续35天)小鼠肝癌H22,C57BL/6小鼠,体内对肝癌H22荷瘤小鼠的抑瘤率达到7424;同时与荷瘤空白对照组及正常空白对照组相比高剂量
22、组荷瘤小鼠腹腔M的吞噬能力、NK 及LAK 细胞的细胞毒活性显著提高(P001),T细胞转化能力及脾细胞抗体生成能力显著增强(P001)血清IL一2、IL一12及TNF等细胞因子水平显著提高(P001)。中剂量组与低剂量组比较只有NK细胞毒活性有显著提高(P001)中、低剂量组与正常空白对照组及荷瘤空白对照组比较LAK细胞细胞毒活性、T细胞转化能力及血清TNFa水平均有显著提高(P001)。Meng etal.(2005)液态发酵樟芝菌丝体醇沉物(250mg/kg,连续15天)小鼠肝癌H22,SPF级昆明小鼠,体内对小鼠肝癌H22 肿瘤的体内抑制极显著(p001,抑瘤大于70.44%),对脾脏
23、等免疫器官的功能有调节作用,尤其是对自然杀伤细胞的增强作用,效果明显好于化疗药物环磷酰胺。Wang et al.(2010)人体试验樟芝菌丝体胶囊,400mg/粒,每日两粒,持续两周。健康运功员志愿者能够显著提升个体运动后免疫球蛋白浓度,在肝指数上对GPT呈现显著差异,GOT虽有下降但不显著(建议增加每日摄入量)。Qiao et al.(2008)2.6 樟芝的安全性评价在过去的二十年当中,台湾政府投入了大量的人力物力财力对于樟芝的安全性进行了全面地研究,其中由台湾经济部辅助成立的科专计划研究中,总共委托了五个单位(医院或研究单位)进行安全性实验,其结果显示樟芝属于无毒级物质,可以放心使用。这
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